عزل الغدد الثديية الماوس سليمة، وكلها لتحليل التعبير المصفوفة خارج الخلية ومورفولوجية الغدة
Summary
هنا، نحن نقدم بروتوكول لعزل الماوس كله، سليمة الغدد الثديية للتحقيق في المصفوفة خارج الخلية (ECM) التعبير ومورفولوجيا الأقنية. الغدد البطن الماوس #4 استخرجت من الفئران موتهم الإناث 8-10 الأسبوع القديمة، ثابتة في الفورمالين مخزنة محايدة ومقطوع والملون باستخدام إيمونوهيستوتشيميستري للبروتينات إدارة المحتوى في المؤسسة.
Abstract
وكان الهدف من هذا الإجراء لحصاد الغدد الثديية البطن #4 من الإناث من الفئران موتهم من أجل تقييم التعبير إدارة المحتوى في المؤسسة، والهندسة المعمارية الأقنية. وهنا جيب صغير تحت الجلد تم إنشاؤه باستخدام مقص مايو كلينيك، السماح بفصل الغدد داخل الأنسجة تحت الجلد من الصفاق الكامنة. وساعد في التصور الغدد باستخدام 3.5 x-R الجراحية الصغرى الصفائحي. قذف كان مقلوب ويعلق مرة أخرى تحديد السماح لمنصات الدهون الثديية سليمة. وكان تشريح كل الغدد البطن #4 صراحة بانزلاق شفرة المبضع أفقياً بين طبقة تحت الجلد والغدد. فورا بعد الحصاد، ووضعت الغدد في 10% فورمالين مخزنة محايدة لمعالجة الأنسجة اللاحقة. استئصال غدة كامل مفيد لأنه يقضي على الدرجة الأولى خطر استبعاد هامة على مستوى الأنسجة التفاعلات بين الخلايا الظهارية الأقنية وغيرهم من السكان الخلوية ميكرونفيرونمينتال التي يمكن أن تضيع في خزعة جزئية. عيب واحد من المنهجية هو استخدام مقاطع المسلسل من الأنسجة الثابتة مما يحد من تحليلات للأقنية التعبير morphogenesis والبروتين إلى مواقع منفصلة داخل الغدة. على هذا النحو، تغييرات في التعبير الهندسة المعمارية والبروتين الأقنية في 3 الأبعاد (3D) لا يسهل الحصول عليها. عموما، الأسلوب المطبق للدراسات التي تتطلب الغدد الثديية موريني أسرة سليمة للتحقيقات المصب مثل سرطان الثدي أو morphogenesis الأقنية التنموية.
Introduction
سرطان الثدي يتسم بدرجة كبيرة من أنسجة التليف1،2،،من34. يشار إلى إدارة المحتوى في المؤسسة، هذا الكيان غير الخلوية توجد بدرجات متفاوتة في جميع الأنسجة وتتكون أساسا من ميشوورك معقدة من كولاجينس فيبريلار وغير فيبريلار، الايلاستين، وجليكوبروتينس بالإضافة إلى جزيئات مختلفة مما يشير إلى أن المحتبسة في هذه المصفوفة. تحت شروط التماثل الساكن، ترسب وتدهور لإدارة المحتوى في المؤسسة مراقبة شديدة. 5 خلال tumorigenesis الثدي، هو تعطل توازن الترسيب إدارة المحتوى في المؤسسة والتدهور. على هذا النحو، أبلغ عن أورام الثدي للتعبير عن البروتينات ECM وفيرة مثل collagens وفيبرونيكتين وتيناسسين-جيم بين أمور أخرى. 6 وقد تم توثيق التعبير غير طبيعي لهذه البروتينات بالإضافة إلى زيادة أنماط crosslinking مصفوفة لتعزيز الثدي ورم التقدم وورم خبيث والعلاج المقاومة1،3، 47،،،من89.
وأجرى تقييم مورفولوجيا الأقنية وتشكيل إدارة المحتوى في المؤسسة، العزلة الغدد الثديية سليمة. هنا، استخدمنا الإناث الفئران موتهم قاصرة كافيولين 1، وبروتين غشائي لا يتجزأ الذي ارتبط عدوانية الثدي ورم توقيع10،،من1112، والتحكم B6 موتهم الإناث الفئران. تجهيز غذائها وتلطيخ هذه الأنسجة يسمح بتحديد عدة بروتينات ECM جنبا إلى جنب مع توصيف مورفولوجيا الأقنية.
وعموما، يعطي عزلة كاملة، سليمة من الغدد الثديية الباحثين الفرصة للتحقيق على مستوى الأنسجة المورفولوجية أو الخلوية التغيرات التي تحدث استجابة لعوامل خارجية أو داخلية. عيوب تقنية ترتبط بتحليلات لأقسام الأنسجة البعد (2D) 2 بدلاً من منظور ثلاثي الأبعاد، مما يفضي إلى صورة أكثر اكتمالا مورفولوجية معقدة من شجرة الأقنية. نظراً للطابع المعقد لخلية خلية والخلية-ECM التفاعلات التي تحدث في الغدة الثديية، عزل الغدد سليمة كاملة، ومفيدة لتحليل كفاءة الأقنية مورفولوجيا والبروتين التعبير في مختلف المناطق من الفاري الثديية غدة.
Protocol
Representative Results
Discussion
في الورقة، التي وصفناها تقنية لعزل الغدد الثديية الماوس سليمة لإجراء تحاليل نسيجية المصب التعبير إدارة المحتوى في المؤسسة ومورفولوجيا الأقنية. فيما يتعلق بتحليلات مورفولوجية الأقنية، تمكن هذه المنهجية التحقيق السريع في الأقنية العمارة أساس الخروج من أقسام نسيجية الملون. طرق أخرى لتحلي…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب يود أن ينوه وايلز نيسان/أبريل والدكتور روجيه بروديرسون للمساعدة مع نيكروبسي الحيوانية وغده العزلة، على التوالي. التمويل اللازم لهذا العمل وأيد مراكز “فيلادلفيا كلية الطب التقويمي” “اضطرابات مزمنة من الشيخوخة”.
Materials
| Light Microscope | Olympus | BX43 | |
| Microscope Camera | Olympus | DP73 | |
| Image Analysis Software | Olympus | cellSens Entry software | |
| NIH | ImageJ | ||
| 3.5x-R Surgical Micro Loupes | Rose Micro Solutions | Magnification at researcher's preference | |
| Mayo Scissors | Medline | DYND04035 | |
| Staining Rack | Fisher Scientific | 121 | |
| Staining Dish | Fisher Scientific | 112 | |
| Coplin Jars | Fisher Scientific | 19-4 | |
| Glass coverslips | Fisher Scientific | 12-550-15 | Size appropriate for tissue |
| IHC EnVision+ Kit (HRP, Mouse, DAB+) | Dako | K400611-2 | |
| Picrosirius Red Kit | Abcam | AB150681 | |
| Eosin Y, alcoholic | Sigma-Aldrich | HT110132 | |
| Harris Hematoxylin | Sigma-Aldrich | HHS16 | |
| Donkey Serum | EMD Millipore | S30 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Xylenes, Reagent Grade | Sigma-Aldrich | 214736 | |
| Ethanol, 200 proof | Sigma-Aldrich | 792780 | suitable for molecular biology |
| Phosphate Buffered Saline, 1x | Gibco | 10010023 | |
| Sodium Citrate | Fisher Scientific | S279-500 | |
| Calcium Carbonate | Sigma-Aldrich | 202932 | |
| Permanent Mounting Medium | Dako | S1964 | |
| Eukitt's Mounting Medium | Sigma-Aldrich | 3989 | |
| Fibronectin antibody | Abcam | AB23750 | |
| Tenascin-C antibody | Abcam | AB108930 | |
| Alpha Smooth Muscle Actin antibody | Abcam | AB124964 | |
| Dako Envision Dual Link System HRP | Dako | K4065 |
References
- Gao-Feng Xiong, R. X. Function of cancer cell-derived extracellular matrix in tumor progression. J Cancer Metastasis Treat. 2, 357-364 (2016).
- Place, A. E., Jin Huh, S., Polyak, K. The microenvironment in breast cancer progression: biology and implications for treatment. Breast Cancer Res. 13 (6), 227 (2011).
- Provenzano, P. P., et al. Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion. BMC Med. 4 (1), 38 (2006).
- Provenzano, P. P., et al. Collagen density promotes mammary tumor initiation and progression. BMC Med. 6, 11 (2008).
- Cox, T. R., Erler, J. T. Remodeling and homeostasis of the extracellular matrix: implications for fibrotic diseases and cancer. Dis Model Mech. 4 (2), 165-178 (2011).
- Ioachim, E., et al. Immunohistochemical expression of extracellular matrix components tenascin, fibronectin, collagen type IV and laminin in breast cancer: their prognostic value and role in tumour invasion and progression. Eur J Cancer. 38 (18), 2362-2370 (2002).
- Barkan, D., et al. Metastatic growth from dormant cells induced by a col-I-enriched fibrotic environment. Cancer Res. 70 (14), 5706-5716 (2010).
- Levental, K. R., et al. Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling. Cell. 139 (5), 891-906 (2009).
- Wang, J. P., Hielscher, A. Fibronectin: How Its Aberrant Expression in Tumors May Improve Therapeutic Targeting. J Cancer. 8 (4), 674-682 (2017).
- Qian, N., et al. Prognostic significance of tumor/stromal caveolin-1 expression in breast cancer patients. Cancer Sci. 102 (8), 1590-1596 (2011).
- Simpkins, S. A., Hanby, A. M., Holliday, D. L., Speirs, V. Clinical and functional significance of loss of caveolin-1 expression in breast cancer-associated fibroblasts. J Pathol. 227 (4), 490-498 (2012).
- Witkiewicz, A. K., et al. An absence of stromal caveolin-1 expression predicts early tumor recurrence and poor clinical outcome in human breast cancers. Am J Pathol. 174 (6), 2023-2034 (2009).
- Macias, H., Hinck, L. Mammary gland development. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1 (4), 533-557 (2012).
- Caligioni, C. S. Assessing reproductive status/stages in mice. Curr Protoc Neurosci. , (2009).
- Cannata, D., et al. Elevated circulating IGF-I promotes mammary gland development and proliferation. Endocrinology. 151 (12), 5751-5761 (2010).
- Thompson, C., Rahim, S., Arnold, J., Hielscher, A. Loss of caveolin-1 alters extracellular matrix protein expression and ductal architecture in murine mammary glands. PLoS One. 12 (2), 0172067 (2017).
- Williams, C. M., Engler, A. J., Slone, R. D., Galante, L. L., Schwarzbauer, J. E. Fibronectin expression modulates mammary epithelial cell proliferation during acinar differentiation. Cancer Res. 68 (9), 3185-3192 (2008).
- Krause, S., Brock, A., Ingber, D. E. Intraductal injection for localized drug delivery to the mouse mammary gland. J Vis Exp. (80), (2013).
