そのままに、全体のマウス乳腺の腺の形態と細胞外マトリックス式の分析のための分離
Summary
ここでは、乳腺細胞外マトリックス (ECM) 式および膵管の形態を検討する提案全体、そのままマウスの隔離のためのプロトコル。マウス #4 腹部腺は、8-10 週齢雌未マウス、中性緩衝ホルマリンで固定、断面、ECM 蛋白質の免疫組織化学を用いたステンド グラスから抽出されました。
Abstract
この手順の目的は、ECM 式と管のアーキテクチャを評価するために雌の未経マウスから #4 腹部乳腺を収穫するためだった。ここでは、皮膚の下の小さなポケットは、マヨはさみ、基になる腹膜から皮下組織内腺の分離を許可するを使用して作成されました。腺の可視化は、3.5 の使用によって助けられた x R 外科用マイクロ ルーペ。ペルトは逆になったし、ヘアケアのままの乳腺の脂肪パッドの識別。#4 腹部腺の皮下層と腺の間メスの刃を横方向に摺動によって切開しぶっきらぼう。、収穫後すぐに腺 10% 中性緩衝ホルマリン後続のティッシュの処理のために置かれました。それは主に膵管上皮細胞と部分生検で見逃される可能性が他のアイソレータケージ細胞集団の重要な組織全体の相互作用を除外するリスクを排除するため、全体の腺の切除は有利です。方法論の 1 つの欠点は、腺内の個別の場所に管の形態形成および蛋白質の表現の分析を制限する固定組織から連続切片の使用です。など、3 次元 (3 D) で管のアーキテクチャおよび蛋白質の表現の変更は容易に獲得可能ではないです。全体的にみて、手法は全体そのままマウス乳腺発達性膵管の形態や乳房癌など下流の調査のために必要とする研究に適用されます。
Introduction
乳がんは、実質的な組織線維症1,2,3,4度が特徴です。ECM と呼ばれる、この非携帯電話エンティティはすべての組織に様々 な程度で発見され維と非フィブリル型コラーゲン、エラスチンのに加えて、様々 なシグナル分子の糖タンパク質の複雑な網目の主に構成されていますこの行列で隔離。恒常性の条件の下で成膜と ECM の劣化が厳しく管理します。5乳腺腫瘍、ECM の沈着と分解のバランスが中断されます。そのため、コラーゲン、フィブロネクチン、テネイシン-C 他の中など豊富な ECM 蛋白質を表現する乳腺腫瘍が報告されています。6マトリックス架橋の増加パターンに加えてこれらの蛋白質の異常発現は乳房腫瘍の進行・転移・治療抵抗1,の3、を促進するために記載されている4,7,8,9。
ECM 組成および膵管の形態を評価するためにそのまま乳腺の分離を行った。ここでは、我々 欠乏未メスマウス カベオリン 1, 内在性膜タンパク質は積極的にリンクされている乳房の腫瘍署名10、11,12、女性未 B6 を制御マウス。組織学的処理およびこれらのティッシュの汚損、管形態の特性と共にいくつかの ECM タンパク質の同定を許可しました。
全体的にみて、全体をそのまま乳腺の分離は、研究者に, 外的あるいは内的要因に応答して発生する組織全体の形態や細胞の変化を調査する機会を与えます。技術の欠点は、膵のツリーの複雑な形態のより完全な画像をもたらすと 3 D 視点とは対照的の 2 次元 (2 D) 組織切片の解析に関連付けられます。乳腺で行われる細胞と細胞外マトリクスの相互作用の複雑さを考えると、全体、そのまま腺の分離が効率的にマウス乳腺の様々 な地域で膵管の形態とタンパク質発現の分析に有利です腺。
Protocol
Representative Results
Discussion
論文では, ECM 式および膵管の形態の下流組織学的解析のためそのままマウス乳腺を分離する方法を説明しました。膵管の形態の分析に関しては、この手法は、染色標本に基づいて管建築の迅速な調査を可能。 にします。管分析の他の方法は技術的に挑戦的で、時間がかかるかもしれない方法管のツリーの視覚化を有効にする染料の注射に依存します。
乳癌で ECM を異常?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は、それぞれ動物の剖検と腺の分離について 4 月と博士ロジャー ・ Broderson を認めたいと思います。この仕事のための資金は、慢性疾患の高齢化のためフィラデルフィア大学整骨医学センターによって支えられました。
Materials
| Light Microscope | Olympus | BX43 | |
| Microscope Camera | Olympus | DP73 | |
| Image Analysis Software | Olympus | cellSens Entry software | |
| NIH | ImageJ | ||
| 3.5x-R Surgical Micro Loupes | Rose Micro Solutions | Magnification at researcher's preference | |
| Mayo Scissors | Medline | DYND04035 | |
| Staining Rack | Fisher Scientific | 121 | |
| Staining Dish | Fisher Scientific | 112 | |
| Coplin Jars | Fisher Scientific | 19-4 | |
| Glass coverslips | Fisher Scientific | 12-550-15 | Size appropriate for tissue |
| IHC EnVision+ Kit (HRP, Mouse, DAB+) | Dako | K400611-2 | |
| Picrosirius Red Kit | Abcam | AB150681 | |
| Eosin Y, alcoholic | Sigma-Aldrich | HT110132 | |
| Harris Hematoxylin | Sigma-Aldrich | HHS16 | |
| Donkey Serum | EMD Millipore | S30 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Xylenes, Reagent Grade | Sigma-Aldrich | 214736 | |
| Ethanol, 200 proof | Sigma-Aldrich | 792780 | suitable for molecular biology |
| Phosphate Buffered Saline, 1x | Gibco | 10010023 | |
| Sodium Citrate | Fisher Scientific | S279-500 | |
| Calcium Carbonate | Sigma-Aldrich | 202932 | |
| Permanent Mounting Medium | Dako | S1964 | |
| Eukitt's Mounting Medium | Sigma-Aldrich | 3989 | |
| Fibronectin antibody | Abcam | AB23750 | |
| Tenascin-C antibody | Abcam | AB108930 | |
| Alpha Smooth Muscle Actin antibody | Abcam | AB124964 | |
| Dako Envision Dual Link System HRP | Dako | K4065 |
References
- Gao-Feng Xiong, R. X. Function of cancer cell-derived extracellular matrix in tumor progression. J Cancer Metastasis Treat. 2, 357-364 (2016).
- Place, A. E., Jin Huh, S., Polyak, K. The microenvironment in breast cancer progression: biology and implications for treatment. Breast Cancer Res. 13 (6), 227 (2011).
- Provenzano, P. P., et al. Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion. BMC Med. 4 (1), 38 (2006).
- Provenzano, P. P., et al. Collagen density promotes mammary tumor initiation and progression. BMC Med. 6, 11 (2008).
- Cox, T. R., Erler, J. T. Remodeling and homeostasis of the extracellular matrix: implications for fibrotic diseases and cancer. Dis Model Mech. 4 (2), 165-178 (2011).
- Ioachim, E., et al. Immunohistochemical expression of extracellular matrix components tenascin, fibronectin, collagen type IV and laminin in breast cancer: their prognostic value and role in tumour invasion and progression. Eur J Cancer. 38 (18), 2362-2370 (2002).
- Barkan, D., et al. Metastatic growth from dormant cells induced by a col-I-enriched fibrotic environment. Cancer Res. 70 (14), 5706-5716 (2010).
- Levental, K. R., et al. Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling. Cell. 139 (5), 891-906 (2009).
- Wang, J. P., Hielscher, A. Fibronectin: How Its Aberrant Expression in Tumors May Improve Therapeutic Targeting. J Cancer. 8 (4), 674-682 (2017).
- Qian, N., et al. Prognostic significance of tumor/stromal caveolin-1 expression in breast cancer patients. Cancer Sci. 102 (8), 1590-1596 (2011).
- Simpkins, S. A., Hanby, A. M., Holliday, D. L., Speirs, V. Clinical and functional significance of loss of caveolin-1 expression in breast cancer-associated fibroblasts. J Pathol. 227 (4), 490-498 (2012).
- Witkiewicz, A. K., et al. An absence of stromal caveolin-1 expression predicts early tumor recurrence and poor clinical outcome in human breast cancers. Am J Pathol. 174 (6), 2023-2034 (2009).
- Macias, H., Hinck, L. Mammary gland development. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1 (4), 533-557 (2012).
- Caligioni, C. S. Assessing reproductive status/stages in mice. Curr Protoc Neurosci. , (2009).
- Cannata, D., et al. Elevated circulating IGF-I promotes mammary gland development and proliferation. Endocrinology. 151 (12), 5751-5761 (2010).
- Thompson, C., Rahim, S., Arnold, J., Hielscher, A. Loss of caveolin-1 alters extracellular matrix protein expression and ductal architecture in murine mammary glands. PLoS One. 12 (2), 0172067 (2017).
- Williams, C. M., Engler, A. J., Slone, R. D., Galante, L. L., Schwarzbauer, J. E. Fibronectin expression modulates mammary epithelial cell proliferation during acinar differentiation. Cancer Res. 68 (9), 3185-3192 (2008).
- Krause, S., Brock, A., Ingber, D. E. Intraductal injection for localized drug delivery to the mouse mammary gland. J Vis Exp. (80), (2013).
