Combinant la synchronisation cellulaire mitotique et microscopie confocale haute résolution pour étudier le rôle des protéines multifonctionnelles Cycle cellulaire au cours de la mitose
Summary
Nous présentons un protocole pour la synchronisation de la thymidine double de cellules HeLa suivie d’analyse à l’aide de la microscopie confocale haute résolution. Cette méthode est essentielle pour obtenir le grand nombre de cellules qui procèdent de façon synchrone de la phase S de mitose, permettant des études sur les rôles mitotiques de protéines multifonctionnelles qui possèdent également des fonctions de l’interphase.
Abstract
Étude sur les divers événements de régulation du cycle cellulaire en fonction de la phase fournit une compréhension claire de la division et la croissance des cellules. La synchronisation des populations cellulaires à des stades spécifiques du cycle cellulaire s’est avérée pour être très utile dans ces efforts expérimentaux. Synchronisation des cellules par un traitement avec des produits chimiques qui sont relativement moins toxique peut être avantageuse sur l’utilisation de médicaments inhibiteurs pharmacologiques pour l’étude des événements de cycle de cellules qui en résulte et obtenir l’enrichissement spécifique de certains stades mitotiques. Nous décrivons ici le protocole de synchronisation des cellules humaines à des stades différents de la cellule du cycle, comprenant à la fois en phase S et phase M avec un bloc double thymidine et libérer la procédure pour l’étude de la fonctionnalité des protéines mitotiques dans l’alignement des chromosomes et la ségrégation. Ce protocole a été extrêmement utile pour étudier les rôles mitotiques des protéines multifonctionnelles qui possèdent des fonctions interphase établies. Dans notre cas, le rôle mitotique de Cdt1, une protéine essentielle pour la réplication origine licences en phase G1, peut être étudié efficacement que lorsque Cdt1 G2/M-spécifiques peuvent être épuisés. Les auteurs décrivent le protocole détaillé pour épuisement des Cdt1 G2/M-spécifique à l’aide de la synchronisation de la thymidine double. Aussi, nous expliquer le protocole de la fixation de la cellule et vivre l’imagerie cellulaire à l’aide de la microscopie confocale haute résolution après la sortie de la thymidine. La méthode est également utile pour analyser la fonction des protéines mitotiques sous des conditions physiologiques et perturbées comme pour Hec1, une composante de la Ndc80 complexe, car elle permet d’obtenir de grands échantillons de taille des cellules mitotiques pour fixe et de cellules vivantes l’analyse que nous montrons ici.
Introduction
Dans le cycle cellulaire, les cellules subissent une série d’événements fortement réglementées et contrôlées dans le temps pour la reproduction exacte de leur génome et leur multiplication. Chez les mammifères, le cycle cellulaire se compose de l’interphase et de la phase M. En interphase, qui se compose de trois phases G1, S et G2, la cellule duplique son génome et subit une croissance qui est nécessaire à la progression de cycle cellulaire normal1,2. Dans la phase M, qui se compose de la mitose (prophase prométaphase, métaphase, anaphase et télophase) et la cytocinèse, une cellule parentale produit deux cellules filles génétiquement identiques. Lors de la mitose, sœur de chromatides-sœurs de génome dupliqué sont condensée (prophase) et sont capturés à leurs kinétochores par des microtubules du fuseau mitotique assemblé (prométaphase), qui pousse leur alignement à la plaque métaphasique (métaphase), suivie de leur égale à ségrégation lorsque sœur chromatides sont divisés vers et transportés vers l’axe opposé de polonais (anaphase). Les deux cellules filles sont physiquement séparées de l’activité d’un anneau contractile axée sur l’actine (télophase et cytocinèse). Le kinétochore est une structure spécialisée de nature protéique qui assemble dans la région centromérique des chromatides et servent de sites de fixation pour les microtubules du fuseau. Sa fonction principale est de conduire la capture de chromosome, alignement et aide à corriger une mauvaise broche microtubule pièce jointe, tandis que la médiation du point de contrôle Assemblée broche pour maintenir la fidélité du chromosome ségrégation3,4.
La technique de synchronisation de la cellule est un outil idéal pour comprendre les événements moléculaires et structurales impliqués dans la progression du cycle cellulaire. Cette approche a été utilisée pour enrichir les populations cellulaires à des phases spécifiques de différents types d’analyses, y compris le profilage de l’expression génique, analyses de processus biochimiques cellulaires et détection de localisation sous-cellulaire des protéines. Des cellules de mammifères synchronisés peuvent être utilisés non seulement pour l’étude des produits des gènes individuels, mais aussi des approches mettant en cause l’analyse des génomes entiers, y compris l’analyse de microarray de gene expression5, miRNA expression patterns6, régulation traductionnelle7et l’analyse protéomique de protéine modifications8. Synchronisation peut également être utilisée pour étudier les effets de l’expression des gènes ou des protéines précipitation ou knock out, ou de produits chimiques sur la progression du cycle cellulaire.
Les cellules peuvent être synchronisés aux différents stades du cycle cellulaire. Méthodes physiques et chimiques sont largement utilisés pour la synchronisation de la cellule. Les critères les plus importants pour la synchronisation de la cellule sont que la synchronisation soit photo-effet et réversible. En raison des conséquences indésirables potentiels cellulaires de synchroniser des cellules par des agents pharmacologiques, les méthodes chimiques peuvent être avantageuses pour l’étude des événements de cycle de cellules clés. Par exemple, hydroxyurée, amphidicolin, mimosine et lovastatine, peuvent être utilisés pour la synchronisation des cellules en phase G1/S mais, en raison de leurs effets sur les voies biochimiques, qu’ils inhibent, ils activer des mécanismes de contrôle de cycle cellulaire et de tuent un important fraction des cellules9,10. En revanche, rétro-inhibition de la réplication de l’ADN en ajoutant thymidine dans les milieux de croissance, appelé « bloc de la thymidine », peuvent arrêter le cycle cellulaire à certains points11,12,13. Cellules peuvent aussi être synchronisés en phase G2/M en traitant avec la nocodazole et RO-33069,14. La nocodazole, qui empêche l’assemblage des microtubules, a une cytotoxicité relativement élevée. En outre, arrêté à la nocodazole cellules peuvent retourner au interphase précocement par glissement mitotique. Double thymidine bloc arrestation des cellules en phase G1/S et après la sortie du bloc, les cellules se trouvent à procéder de façon synchrone par le biais de G2 et en mitose. La progression normale du cycle cellulaire des cellules provenant du bloc de la thymidine peut être observée en microscopie confocale haute résolution par fixation cellulaire ou imagerie live. L’effet d’une perturbation des protéines mitotiques peut être étudiée précisément lorsque les cellules entrer et passer par mitose après la sortie de bloc double thymidine. Cdt1, une protéine multifonctionnelle, participe à l’origine de réplication ADN licence en phase G1 et est également nécessaire pour les pièces jointes de microtubules kinétochores durant la mitose,15. Pour étudier la fonction des Cdt1 durant la mitose, on a besoin d’adopter une méthode qui évite l’effet de son appauvrissement sur l’autorisation de réplication au cours de la phase G1, alors qu’en même temps effectuer son appauvrissement spécifiquement au cours de la phase G2/M seulement. Nous présentons ici des protocoles détaillés basés sur le bloc de thymidine double pour étudier le rôle mitotique des protéines des fonctions multiples au cours des différentes étapes du cycle cellulaire par l’imagerie fixe et cellules vivantes.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’avantage essentiel de la synchronisation de la thymidine double, c’est qu’il fournit un échantillon accrue des cellules mitotiques dans une fenêtre de peu de temps avec plusieurs de ces cellules entrant dans la mitose à l’unisson, également permettant ainsi des analyses de l’alignement du chromosome, bipolaire avec un rendement beaucoup plus élevé d’axe formation et la ségrégation des chromosomes.
De nombreux complexes de protéine régulatrice et voies de signalisation s…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous sommes reconnaissants à m. Kozo Tanaka du Tohoku University, Japon pour le partage des cellules HeLa exprimant de manière stable mCherry-Histone H2B et GFP-α-tubuline. Ce travail a été soutenu par une subvention NCI à DV (R00CA178188) et par des fonds de démarrage de la Northwestern University.
Materials
| DMEM (1X) | Life Technologies | 11965-092 | Store at 4 degree C |
| DPBS (1X) | Life Technologies | 14190-144 | Store at 4 degree C |
| Leibovitz’s (1X) L-15 medium | Life Technologies | 21083-027 | Store at 4 degree C |
| Serum reduced medium (Opti-MEM) | Life Technologies | 319-85-070 | Store at 4 degree C |
| Penicillin and streptomycin | Life Technologies | 15070-063 (Pen Strep) | 1:1000 dilution |
| Dharmafect2 | GE Dharmacon | T-2002-02 | Store at 4 degree C |
| Thymidine | MP Biomedicals LLC | 103056 | Dissolved in sterile distiled water |
| Cdt1 siRNA | Life Technologies | Ref 10 | |
| Hec1 siRNA | Life Technologies | Ref 13 | |
| HeLa cells expressing GFP-H2B | |||
| HeLa cells expressing GFP-α-tubulin and mCherry H2B | Generous gift from Dr. Kozo Tanaka of Tohoku university, Japan | ||
| Formaldehyde solution | Sigma-Aldrich Corporation | F8775 | Toxic, needs caution |
| DAPI | Sigma-Aldrich Corporation | D9542 | Toxic, needs caution |
| Mouse anti-α-tubulin | Santa Cruz Biotechnology | Sc32293 | 1:1000 dilution |
| Rabbit ant-Zwint1 | Bethyl | A300-781A | 1:400 dilution |
| Mouse anti-phospho-γH2AX (Ser139) | Upstate Biotechnology | 05-626, clone JBW301 | 1:300 dilution |
| Alexa 488 | Jackson ImmunoResearch | 1:250 dilution | |
| Rodamine Red-X | Jackson ImmunoResearch | 1:250 dilution | |
| BioLite 6 well multidish | Thermo Fisher Scientific | 130184 | |
| 35MM Glass bottom dish | MatTek Corporation | P35GCOL-1.5-14-C | |
| Nikon Eclipse TiE inverted microscope | Nikon Instruments | ||
| Spinning disc for confocal | Yokagawa | CSU-X1 | |
| Ultra 888 EM-CCD Camera | Andor | iXon Ultra EMCCD | |
| 4 wave length laser | Agilent Technologies | ||
| Incubation System for Microscopes | Tokai Hit | TIZB | |
| NIS-elements software | Nikon Instruments |
References
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