Une méthode Simple et efficace pour établir les NK et les lymphocytes T lignes provenant de Patients avec une Infection chronique Active Virus Epstein - Barr

Résumé

Une méthode simple permettant d’obtenir des clones NK et des lymphocytes T chez des patients CAEBV a été développée avec rendement élevé, une petite quantité de sang périphérique et une faible dose d’il-2.

Résumé

Un certain nombre de méthodes ont été décrit pour établir des lignées de cellules NK/T de patients atteints de syndrome lymphoprolifératif ou de lymphome. Ces méthodes employées des cellules nourricières, les cellules NK ou T purifiées autant que 10 ml de sang ou une dose élevée d’il-2. Cette étude présente une nouvelle méthode avec une stratégie simple et puissante pour établir des lignes NK et des lymphocytes T en cultivant le périphérique du sang des cellules mononucléaires (PBMC) avec l’ajout d’il-2 de recombinante humaine (rhIL-2) et utilise aussi peu que 2 mL de sang total. Les cellules peuvent proliférer rapidement dans les deux semaines et être maintenues pendant plus de 3 mois. Avec cette méthode, 7 lignes de NK ou les lymphocytes T ont été établis avec un taux de réussite élevé. Cette méthode est simple, fiable et applicable à l’établissement de lignées cellulaires de plus de cas de lymphome à cellules NK/T ou de CAEBV.

Introduction

Virus d’Epstein - Barr (EBV) est omniprésent et infecte non seulement B cellules, mais aussi T et natural killer (NK), ce qui provoque un certain nombre de maladies de Syndromes lymphoprolifératifs associés à l’EBV NK/T (LPD) et Lymphome/leucémie, telles que l’activation macrophagique associés à EBV familiale, hydroa vacciniforme type lymphome, lymphome à cellules NK/T extraganglionnaires, type nasal et NK agressive cellule leucémie^1,2,3. Parmi ceux-ci est la maladie chronique grave actif EBV (SCAEBV), qui est incident principalement en Asie du sud-est, et qui est maintenant ....

Protocole

Cette étude a été approuvée par le Comité d’éthique de l’Institut de génétique et biologie du développement, Académie chinoise des Sciences, et le protocole suit les lignes directrices pour le bien-être de l’humanité.

Remarque : Voir la Figure 1 pour un schéma du flux de travail.

1. isolement des PBMC de Patients CAEBV

1. Purifier les PBMC primaire de 2 mL de sang total des patients CAEBV en dégradé (par exemple, gradient de Ficoll-plaque) centrifugation en suivant les instructions du fabricant. Alternativement, décongelez les PBMC cryoconservé d’azote liquide avec mi....

Résultats

Après que 3 jours culture lors de la création de lignées cellulaires, les cellules polymorphes commencent à apparaître (Figure 2). Après 7 jours, les cellules se développent rapidement, comme le numéro et la viabilité des cellules croissent à un rythme élevé (Figure 3). Petits amas de cellules sont clairement visibles après 10-14 jours de plus en plus, lorsque la concentration en cellules peut dépasser les 3 à 6 × 10⁶........

Discussion

Dans ce protocole, une nouvelle technique pour l’établissement de lignées de cellules NK/T de sang des patients CAEBV a été développée. Comparaison avec les méthodes existantes, l’avantage majeur de cette méthode est sa simplicité et son exigence de seulement une petite quantité de sang, alors qu’il présente un taux de réussite élevé et de bonnes conditions de viabilité des cellules. En outre, les lignées de cellules NK/T peuvent être établies en cultivant des PBMC sans déterminer les types de cellules l’EBV latentes inf.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Anticorps Hu HLA-DR FITC	BD		pour FACS
Hu CD4 FITC	BD	555346	anticorps pour FACS
Hu/NHP CD8 PE	BD	557086	anticorps pour FACS
Hu CD3 PE	BD	555340	Anticorps pour FACS
Hu CD16 FITC 3G8	BD	555406	anticorps pour FACS
Hu/NHP CD56 PE MY31	BD	Anticorps 556647	pour FACS
hu/CD19 PE-Cy7	BD	560728	pour FACS
IL-2 humain	Roche	11147528001
humain	MRC	CCC118-125
Incubateur CO2	SANYO
Centrifuge	Techcomp	CT6T	Microscope de centrifugation
	OLYMPUS CKX53	CKX53
Compteur de cellules automatisé	Countstar	IC 1000	Pour le comptage
24 puits cluster de culture cellulaire	Corning Incorporated	3524	Plaques de polystyrène
25cm2 flacon de culture cellulaire	Nest	707001	Polystyrène
FBS	Gibco	10270	Composant du milieu
cellulaire RPMI Milieu 1640	22400089 de vie		Pour le milieu cellulaire
L-Glutamine	Amresco	374	Composant du milieu cellulaire
100 x solution de pénicilline de streptomycine BioRoYeeBRY-2309	BioRoYee	BRY-2309	Composant du milieu cellulaire
Ficoll paque plus	GE Healthcare	17-1440-03	Pour l’isolement in vitro du lymphocyte
DMSO	Sigma	D2650	Pour la congélation des cellules
cytomètre en flux	BD	BD FACSAria II
soft ware	BD	BD FACSDiva soft ware FACS	analysis

560944 sérum cellulaire