Эффективной и простой метод для установления линии Т-клеток у больных с хроническим активный вирус Эпштейна - Барр инфекции и НК
Summary
С высокой эффективностью, небольшое количество периферической крови и низкодозированные Ил-2 был разработан простой метод для получения клоны Т-клеток и NK CAEBV больных.
Abstract
Ряд методов были описаны установить НК/T клеточных линий от пациентов с лимфомой или лимфопролиферативных синдромом. Эти методы подачи клетки, очищенный НК или T клетки как 10 мл крови или высок дозы Ил-2. Это исследование представляет новый метод с мощной и простой стратегии учредить Т-клеток и NK линии путем культивирования периферической крови мононуклеаров (КСДОР) с добавлением рекомбинантный человеческий Ил-2 (rhIL-2) и использует как маленькое как 2 мл цельной крови. Клетки могут размножаться быстро в две недели и поддерживаться более 3 месяцев. С помощью этого метода были созданы 7 НК или Т-клеток линии с высокий уровень успеха. Этот метод является простым, надежным и применимым к созданию линии клетки от больше случаев CAEBV или НК/Т-клеточной лимфомы.
Introduction
Вирус Эпштейна – Барр (EBV) повсеместно и заражает не только B-клетки, но также T и природных убийца (НК) клетки, что приводит ряд связанных EBV НК/T лимфопролиферативных заболеваний (LPD) и лимфома/лейкоз, например EBV-связанные гемофагоцитный лимфогистиоцитоз, hydroa vacciniforme как лимфома, экстранодальных НК/Т-клеточной лимфомы, носовой тип и агрессивным NK клеток лейкемии1,2,3. Среди них заболевание тяжелой хронической активных EBV (SCAEBV), который является инцидент, главным образом в Восточной Азии, и которая теперь считается LPD, вызванные клоновых расширения EBV-инфицированных T или NK клеток4,5,6, 7, но без очевидной иммунодефицита присутствует в инфекционный мононуклеоз (IM)-как симптомы, включая лихорадку, гепатоспленомегалия, лимфаденопатия и дисфункции печени постоянно или периодически, а также высокой EBV-ДНК загрузки в периферической крови8,9. У пациентов с CAEBV плохой прогноз10,11и его патогенез и роль EBV является неясным. Таким образом, мобильных линий, полученных от связанных EBV НК/T лимфопролиферативных заболеваний и лимфом очень полезны как ячейки модели для разъяснения механизма EBV индуцированной НК или Т-клеток распространения и его отношения с высоким уровнем заболеваемости лейкемией или лимфомы.
На сегодняшний день, были созданы несколько клеточных линий с различными методами12,13,14,,1516. Человеческой линии клеток НК, НК-YS, был создан от НК лимфома/лейкоз, совместного культивирования с линией стромальные клетки мыши как фидер и в присутствии rhIL-2 в концентрации 20U за15мл. KAI3 был другой NK клеток линии от больных с тяжелой комаров аллергии или SCAEBV с аутологичной лимфобластоидных клеток линии (LCL), клетки B, преобразованная EBV, как клетки фидера и добавление rhIL-216100У/мл. SNK6 и SNT8 были получены от опухоли тканей носа НК/T клеток больных лимфомами, добавив высок дозы rhIL-2 (700U/мл)12. С подобную технику SNK-1 клетка был от CAEBV больных, культивированный от КСДОР, удалив Т-клеток и добавив 700U/мл rhIL-213,17. SNT13 и SNT15 были созданы путем удаления CD4 + и CD8 + клетки18. Пока другие Т-клеток и NK клеточных линий от EBV-НК/T LPD пациентов были разработаны с этот метод19.
Недостатки существующих методов, упомянутых выше включают занятости клетки фидера, требование высок дозы IL-2, использования как 10 мл цельной крови или очистки НК/Т-клеток, что является весьма сложной в клинике из-за необходимость проверки, какие типы мобильных что EBV латентно заражает перед началом к культуре. Как CAEBV в основном происходит в детей в Азии, 10 мл крови не является легко приобрести во всех регионах. В этом исследовании мы разработали новый простой метод с высокий уровень успеха установить НК и/или Т-клеток линии путем культивирования КСДОР от CAEBV больных с использованием низких доз rhIL2 и объемом 2 мл цельной крови без клетки фидера. Результаты этого метода доказали свою высокую эффективность и экономия времени.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этом протоколе был разработан Роман технику для создания НК/T клеточных линий из цельной крови больных CAEBV. По сравнению с существующими методами, основным преимуществом данного метода является его простота и его требование лишь небольшого количества крови, в то время как оно exhibits выс…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана ключ проектов Китайской академии наук (KFZD-SW-205), стратегические биологических ресурсов технологии системы поддержки Китайской академии наук (CZBZX-1 и ZSSB-004) и субсидии от национального фонда науки Китая ( 81401640) и Шанхае фонда естественных наук (14ZR1434800).
Materials
| Hu HLA-DR FITC | BD | 560944 | antibody for FACS |
| Hu CD4 FITC | BD | 555346 | antibody for FACS |
| Hu/NHP CD8 PE | BD | 557086 | antibody for FACS |
| Hu CD3 PE | BD | 555340 | antibody for FACS |
| Hu CD16 FITC 3G8 | BD | 555406 | antibody for FACS |
| Hu/NHP CD56 PE MY31 | BD | 556647 | antibody for FACS |
| hu/CD19 PE-Cy7 | BD | 560728 | antibody for FACS |
| human IL-2 | Roche | 11147528001 | |
| human serum | MRC | CCC118-125 | |
| CO2 incubator | SANYO | ||
| Centrifuge | Techcomp | CT6T | Centrifugation |
| microscope | OLYMPUS CKX53 | CKX53 | |
| Automated Cell Counter | Countstar | IC 1000 | For cell counting |
| 24 well cell culture cluster | Corning Incorporated | 3524 | Polystyrene plates |
| 25cm2 cell culture flask | Nest | 707001 | Polystyrene |
| FBS | Gibco | 10270 | Component of cell medium |
| RPMI Medium 1640 | life | 22400089 | For cell medium |
| L-Glutamine | Amresco | 374 | Component of cell medium |
| 100 x streptomycin penicillin solution BioRoYeeBRY-2309 | BioRoYee | BRY-2309 | Component of cell medium |
| Ficoll paque plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | For in vitro isolation of lymphocyte |
| DMSO | Sigma | D2650 | For freezing cells |
| flow cytometer | BD | BD FACSAria II | |
| soft ware | BD | BD FACSDiva soft ware | FACS analysis |
References
- Cohen, J. I. Epstein-Barr virus infection. N Engl J Med. 343 (7), 481-492 (2000).
- Cohen, J. I., Kimura, H., Nakamura, S., Ko, Y. H., Jaffe, E. S. Epstein-Barr virus-associated lymphoproliferative disease in non-immunocompromised hosts: a status report and summary of an international meeting, 8-9 September 2008. Ann Oncol. 20 (9), 1472-1482 (2009).
- Oshimi, K. Progress in understanding and managing natural killer-cell malignancies. Br J Haematol. 139 (4), 532-544 (2007).
- Kawa, K., et al. Mosquito allergy and Epstein-Barr virus-associated T/natural killer-cell lymphoproliferative disease. Blood. 98 (10), 3173-3174 (2001).
- Kimura, H. Pathogenesis of chronic active Epstein-Barr virus infection: is this an infectious disease, lymphoproliferative disorder, or immunodeficiency?. Rev Med Virol. 16 (4), 251-261 (2006).
- Kimura, H., et al. Clinical and virologic characteristics of chronic active Epstein-Barr virus infection. Blood. 98 (2), 280-286 (2001).
- Ohshima, K., et al. Proposed categorization of pathological states of EBV-associated T/natural killer-cell lymphoproliferative disorder (LPD) in children and young adults: overlap with chronic active EBV infection and infantile fulminant EBV T-LPD. Pathol Int. 58 (4), 209-217 (2008).
- Okano, M. Overview and problematic standpoints of severe chronic active Epstein-Barr virus infection syndrome. Crit Rev Oncol Hematol. 44 (3), 273-282 (2002).
- Straus, S. E. The chronic mononucleosis syndrome. J Infect Dis. 157 (3), 405-412 (1988).
- Jones, J. F., et al. T-cell lymphomas containing Epstein-Barr viral DNA in patients with chronic Epstein-Barr virus infections. N Engl J Med. 318 (12), 733-741 (1988).
- Kikuta, H., et al. Epstein-Barr virus genome-positive T lymphocytes in a boy with chronic active EBV infection associated with Kawasaki-like disease. Nature. 333 (6172), 455-457 (1988).
- Nagata, H., et al. Characterization of novel natural killer (NK)-cell and gammadelta T-cell lines established from primary lesions of nasal T/NK-cell lymphomas associated with the Epstein-Barr virus. Blood. 97 (3), 708-713 (2001).
- Nagata, H., et al. Presence of natural killer-cell clones with variable proliferative capacity in chronic active Epstein-Barr virus infection. Pathol Int. 51 (10), 778-785 (2001).
- Tabata, N., et al. Hydroa vacciniforme-like lymphomatoid papulosis in a Japanese child: a new subset. J Am Acad Dermatol. 32 (2 Pt 2), 378-381 (1995).
- Tsuchiyama, J., et al. Characterization of a novel human natural killer-cell line (NK-YS) established from natural killer cell lymphoma/leukemia associated with Epstein-Barr virus infection. Blood. 92 (4), 1374-1383 (1998).
- Tsuge, I., et al. Characterization of Epstein-Barr virus (EBV)-infected natural killer (NK) cell proliferation in patients with severe mosquito allergy; establishment of an IL-2-dependent NK-like cell line. Clin Exp Immunol. 115 (3), 385-392 (1999).
- Zhang, Y., et al. Common cytological and cytogenetic features of Epstein-Barr virus (EBV)-positive natural killer (NK) cells and cell lines derived from patients with nasal T/NK-cell lymphomas, chronic active EBV infection and hydroa vacciniforme-like eruptions. Br J Haematol. 121 (5), 805-814 (2003).
- Oyoshi, M. K., et al. Preferential expansion of Vgamma9-JgammaP/Vdelta2-Jdelta3 gammadelta T cells in nasal T-cell lymphoma and chronic active Epstein-Barr virus infection. Am J Pathol. 162 (5), 1629-1638 (2003).
- Imadome, K., et al. Novel mouse xenograft models reveal a critical role of CD4+ T cells in the proliferation of EBV-infected T and NK cells. PLoS Pathog. 7 (10), e1002326 (2011).
- Shibuya, A., Nagayoshi, K., Nakamura, K., Nakauchi, H. Lymphokine requirement for the generation of natural killer cells from CD34+ hematopoietic progenitor cells. Blood. 85 (12), 3538-3546 (1995).
- Spits, H., Yssel, H. Cloning of Human T and Natural Killer Cells. Methods. 9 (3), 416-421 (1996).
- Liu, X., Xu, C., Duan, Z. A Simple Red Blood Cell Lysis Method for the Establishment of B Lymphoblastoid Cell Lines. J Vis Exp. (119), (2017).
- Kawabe, S., et al. Application of flow cytometric in situ hybridization assay to Epstein-Barr virus-associated T/natural killer cell lymphoproliferative diseases. Cancer Sci. 103 (8), 1481-1488 (2012).
