El efecto del estrés osmótico en vesículas secretoras y exocitosis de monitoreo
Summary
Estrés osmótico afecta la exocitosis y la cantidad de neurotransmisor liberado durante este proceso. Demostramos cómo la combinación de métodos electroquímicos junto con microscopia electrónica de transmisión se puede utilizar para estudiar el efecto de la presión osmótica extracelular sobre la actividad de la exocitosis, tamaño cuántico de la vesícula y la cantidad de neurotransmisor liberado durante la exocitosis.
Abstract
Amperometría grabación de células sometidas a choque osmótico muestran que las células secretores responden a este estrés físico reduciendo la actividad de la exocitosis y la cantidad de neurotransmisor liberado de las vesículas en eventos solo exocitosis. Se ha sugerido que la reducción en los neurotransmisores expulsado es debido a alteraciones en las propiedades biofísicas de la membrana al encogen de las células en respuesta a estrés osmótico y con supuestos no afectan a vesículas secretoras en el citoplasma de la célula por el estrés osmótico extracelular. Amperometría grabación de exocitosis monitorea lo que se libera de las células el momento una vesícula se funde con la membrana plasmática, pero no proporciona información sobre el contenido de la vesícula antes de la fusión de la vesícula se dispara. Por lo tanto, combinando Amperometría grabación con otros métodos analíticos complementarios que son capaces de caracterizar las vesículas secretoras antes exocitosis en las células se activa ofrece un panorama más amplio para examinar cómo secretoras vesículas y el proceso de exocitosis se ven afectados por choque osmótico. Aquí describimos cómo complementar Amperometría grabación intracelular citometría electroquímico y la proyección de imagen de microscopía electrónica (TEM) la transmisión se puede utilizar para caracterizar alteraciones en tamaño y neurotransmisor contenido de vesículas secretoras en el células cromafines en relación con la actividad de exocitosis antes y después de la exposición al estrés osmótico. Al relacionar la información cuantitativa obtenida de experimentos utilizando los tres métodos analíticos, conclusiones fueron realizadas que vesículas secretoras responden al estrés osmótico extracelular reduciendo en tamaño y reduciendo el tamaño cuántico de vesícula mantener una concentración de neurotransmisores de la vesícula constante. Por lo tanto, esto le da algunas aclaraciones con respecto a por qué las vesículas, en respuesta a estrés osmótico, reducen los neurotransmisores cantidad liberados durante lanzamiento de exocitosis. Los registros amperométricos aquí indican que se trata de un proceso reversible y vesícula después de choque osmótico son rellenadas con neurotransmisores cuando son revertidas las células colocadas en un ambiente isotónico.
Introduction
Las células cromafines suprarrenales son células neuroendocrinas que liberan moléculas de neurotransmisores en el torrente sanguíneo. Esto ocurre a través de un proceso celular que consiste en el acoplamiento y fusión de vesículas llenas de neurotransmisores, dando por resultado lanzamiento contenido de las vesículas al espacio extracelular en un proceso llamado exocitosis. Los neurotransmisores (adrenalina y noradrenalina) en las células cromafines son activamente transportados por proteínas de membrana en vesículas grandes de núcleo denso (LDCVs) y almacenados a altas concentraciones (~0.5-1 M)1,2. Acumulación de neurotransmisores dentro de las LDCVs se logra por la afinidad de las moléculas de catecolaminas a la matriz de proteína de núcleo denso intravesicular de chromogranin proteínas (~ 169 mg/mL)3,4,5 ,6y una solución cóctel intravesicular que contiene componentes clave para la carga de catecolaminas y almacenamiento en la vesícula como ATP (125-300 mM)7, Ca2 + (50-100 μm en la solución y ~ 40 mM destinado a la matriz de la proteína)8Mg2 + (5 mM)9, ascorbato (10-30 mM)10y un pH de ~5.511,12. El LDCVs mantienen una condición iso-osmótico con el citoplasma de la célula (310 mOsm/kg)13, aunque la concentración de soluto teórica dentro de las vesículas de la suma hasta más de 750 mM. La composición de los componentes intravesicular no sólo es esencial para la carga y almacenamiento de catecolaminas, sino también para la agregación de los solutos a la matriz de proteína de núcleo denso. Esto reduce la osmolaridad de las vesículas se reduce considerablemente y puede afectar a la catecolamina de la cantidad que se libera durante la exocitosis5,6.
Estudios sobre el efecto de la presión osmótica extracelular en el proceso de exocitosis por grabación amperométricos han divulgado eso alta presión osmótica extracelular inhibe la actividad de exocitosis y reduce el número de neurotransmisores secretados de solo vesícula compartimentos4,14,15,16,17,18,19. Las explicaciones de estas observaciones han especulado sobre el posible mejoramiento de apretadura macromolecular en los célula citoplasma inhibición vesícula fusión eventos y una alteración en las propiedades biofísicas de la membrana que afecta el número de durante la exocitosis de neurotransmisores. Estos pensamientos asumieron que el estrés osmótico extracelular alta no afecta el tamaño cuántico de la vesícula, que define el número de moléculas de neurotransmisor almacenado en un compartimiento de vesícula en fase previa de exocitosis disparada14, 15 , 17 , 19 , 20 , 21. amperométrico medidas de liberación de la exocitosis en las células, un microelectrodo de disco de fibra de carbono se pone en contacto con la superficie de la célula, creando un conjunto experimental hasta imitando la configuración de la sinapsis, donde el sistema amperimétrico electrodo actúa como un detector de postsynaptic (figura 1)22,23. Mediante la estimulación de una célula a la exocitosis, uno puede inducir vesículas llenas de neurotransmisores se fusionan con la membrana plasmática de la célula y liberar el contenido de la vesícula completa o parte en el espacio extracelular. Estas moléculas de neurotransmisor liberadas en la superficie del electrodo pueden ser detectadas vía electroquímica si los neurotransmisores son electroactivos (por ejemplo, las catecolaminas) mediante la aplicación de un potencial redox de + 700 mV vs un electrodo de referencia Ag/AgCl . En consecuencia, una serie de picos de corriente marca la detección de eventos individuales de la exocitosis. De la corriente frente a rastro de tiempo en una grabación amperométrico, el área bajo cada pico amperométrico solo representa la carga detectada por evento de exocitosis y se puede convertir en el topo de neurotransmisores liberados, mediante la ecuación de Faraday. Por lo tanto, los registros amperométricos proporcionan información cuantitativa sobre los neurotransmisores de la cantidad de eventos solo exocitosis e Informe sobre la frecuencia de eventos de exocitosis, pero no presentan información cuantitativa sobre las vesículas secretoras contenido antes de la fusión de la vesícula y liberación del neurotransmisor se ha iniciado.
Por lo tanto, para obtener una mejor comprensión de cómo secretoras vesículas en la célula citoplasma responden al estrés osmótico extracelular antes de que la célula se activa para experimentar la exocitosis, pueden utilizarse otros métodos analíticos complementarios para enriquecer esta información. Por ejemplo, para investigar si estrés osmótico altera el volumen de la vesícula, microscopía electrónica de transmisión (TEM) análisis de la proyección de imagen puede utilizarse para medir el tamaño de la vesícula de las células después de la fijación química. Para examinar si estrés osmótico afecta tamaño cuántico de vesícula, una técnica recientemente desarrollado amperométrico llamada citometría electroquímico intracelular, se puede aplicar para la cuantificación del contenido de vesículas neurotransmisor en vesículas secretoras en su estado nativo cuando todavía que residen en el citoplasma de células vivas26. En la técnica de citometría electroquímico intracelular, un electrodo cilíndrico carbón de fibra de nanotip se inserta suavemente en el citoplasma de células vivas y mediante la aplicación de un potencial de + 700 mV este electrodo (electrodo de referencia de vs un Ag/AgCl), el contenido de catecolaminas de las vesículas puede ser cuantificada por la detección de un pico actual de redox de vesículas solo chocar, absorber y posteriormente estocástico ruptura en la superficie del electrodo y así liberando su contenido contra la electrodo superficial26. Por lo tanto, en la amperimétrica actual versus seguimiento de tiempo, cada evento de ruptura de vesícula solo puede resultar en un transitorio actual y, al integrar el área de cada pico actual, el tamaño cuántico de vesícula puede calcularse usando la ley de Faraday.
Por lo tanto, al relacionar la información cuantitativa obtenida de mediciones de tamaño de vesícula usando proyección de imagen de TEM junto con análisis de tamaño cuántico de vesícula, según lo registrado por citometría electroquímico intracelular, concentración del neurotransmisor de vesícula puede también ser determinado. Esto permite la caracterización de la vesícula cuando las células son expuestas a diferentes condiciones osmóticas y proporciona una mejor visión de cómo las vesículas pueden responder al estrés osmótico extracelular en la etapa antes de la exocitosis. Los resultados de la combinación de estos métodos han demostrado que en presencia de extracelular alta presión osmótica, vesículas reducirán y ajustan su tamaño cuántico y comparar la información cuantitativa sobre los cambios relativos de estas mediciones muestra que al mismo tiempo que se encoge, las vesículas ajustan su contenido y su tamaño para mantener una concentración constante de neurotransmisor del24. Así, esta comprensión es valiosa en la conexión a las observaciones hechas en la liberación de neurotransmisores en las células expuestas a estrés osmótico. En estos protocolos, describimos el uso de estas tres metodologías complementarias que permiten la caracterización de vesículas secretoras como en su entorno nativo responde a la osmolalidad extracelular y los efectos de esta respuesta en la exocitosis proceso. Además de nuestras observaciones anteriores sobre el efecto de alta presión osmótica en la exocitosis24, presentamos experimentos adicionales que describen la recuperación de la célula después de choque osmótico y el efecto de múltiples estímulos de bario en cromafines células.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí presentamos un protocolo y las ventajas de la combinación de tres métodos analíticos complementarios para analizar vesículas secretoras y el proceso de exocitosis para lograr una mejor comprensión de cómo una fuerza física como la presión osmótica puede afectar a las vesículas secretoras y el proceso de exocitosis en células secretoras. Estos métodos incluyen Amperometría de microelectrodo de fibra de carbono, que es un método establecido para grabar la actividad de la exocitosis, citometría electroq…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer al Consejo Sueco de investigación (349-2007-8680) para la financiación y Dalsjöfors Kött AB (Dalsjöfors, Suecia) para la donación de suprarrenales bovinas.
Materials
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P9333 | |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S5761 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M-2670 | |
| Glucose | Sigma Aldrich | G8270 | |
| Collagenase P | Roche, Sweden | 11 213 857 001 | |
| 100-µM Nylon mesh | Fisher Sientific | 08-771-19 | |
| Percoll | Sigma Aldrich | P1677 | |
| Collagen IV coated 60 mm plastic dish | VWR | 354416 | |
| Centrifuge | Avanti J-20XP | ||
| Borosilicate glass capillary | Sutter instrument Co., Novato, CA | ||
| Micropipette puller | Narishing Inc., Japan | PE-21 | |
| Epoxy solutions (A and B) | Epoxy technology, Billerica, MA | ||
| Beveller | Narishing Inc. | EG-400 | |
| Inverted Microscope | Olympus | IX81 | |
| Patch clamp Instrument | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | Axopatch 200B | |
| Micromanipulator | Burleigh Instrument Inc., USA | PCS-5000 | |
| Butane Flame | Multiflame AB, Hässelholm, Sweden | ||
| Transmission electron microscopy | Omega | Leo 912 AB |
References
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