Использование синаптических цинка гистохимии выявить различные регионы и пластинки в развивающихся, так и взрослого мозга
Summary
Мы описываем гистохимические процедуру, которая раскрывает характерные ламинарное и площадных цинка, окрашивания моделей в различных мозга. Цинк окрашивание шаблон может использоваться в сочетании с другими анатомические маркерами надежно различать слои и регионах в развивающихся, так и взрослого мозга.
Abstract
Характеристика мозга анатомической и функциональной организации и развития требует точной идентификации различных нейронных цепей и регионов в незрелых и взрослого мозга. Здесь мы описываем цинка гистохимические пятная процедуру, которая показывает различия в окрашивания моделей среди различных слоев и мозга. Другие использовали эту процедуру не только выявить распределения цинка содержащих нейронов и цепей в головном мозге, но и успешно очертить границы ареала и ламинарные в развивающихся, так и взрослого мозга в нескольких видов. Здесь мы показываем это пятная процедуру с изображениями из развивающихся и взрослого хорька мозги. Мы раскрыть шаблон окрашивание цинка, который служит в качестве анатомического маркера областей и слои и надежно может использоваться для различения визуальные корковых областях в развивающихся, так и взрослых зрительной коры. Основная цель настоящего Протокола заключается в представлении гистохимический метод, который позволяет точное выявление слоев и регионов в развивающихся, так и взрослого мозга, где другие методы не позволяют сделать это. Во-вторых в сочетании с анализом денситометрических изображений, этот метод позволяет оценить распределение синаптических цинка выявить потенциальные изменения на протяжении развития. Этот протокол описывает подробно реагентов, инструменты и шаги, необходимые для последовательно пятно замороженный мозг секций. Хотя этот Протокол описан с помощью хорька мозговой ткани, она может быть легко адаптирована для использования в грызунов, кошки или обезьян также, как и в других регионах мозга.
Introduction
Гистологические пятна традиционно использовались для оказания помощи в идентификации корковых областях в различных видов путем выявления различий в архитектурные особенности. Комбинированное использование гистохимические методы, такие как Ниссль вещество, реактивность цитохрома-оксидазы (CO) или миелина может оказаться плодотворным, как они показывают аналогичные площадной границ в взрослого мозга. Однако эти гистохимические пятна не всегда должным образом выявить четких границ между корковых областях и слоев в незрелых мозга.
В центральной нервной системе цинк имеет несколько важных функций, которые включают стабилизации структуры ДНК, действуя как кофактор фермента, участвуя в многочисленных нормативных функций и действуя в качестве нейромодулятора через свое присутствие в синаптических пузырьков 1. синаптических цинка является уникальной, поскольку она могут быть визуализированы с помощью гистологических методов, в то время как белок прыгните цинка не может быть визуализирован2. Эта возможность была использована раскрыть структуре синаптических цинка в различных регионах корковых и синаптической цинка гистохимии использовалась в ряде исследований. Подмножество глутаматергические нейронов коры головного мозга содержат цинка в пресинаптическом везикулы в пределах их аксона терминалы3,4. Гистохимических исследований показали гетерогенных распределение синаптических цинка в коре5,6,7. Там, как представляется, различные площадной и ламинарные распределения методами реагирования цинка в различных регионах кортикального слоя (например, визуальный против соматосенсорной коры), или слоев (например, уровни цинка в supragranular и infragranular слои первичной зрительной коры значительно выше, чем в thalamocortical входного слоя IV с относительно низкой синаптических цинка уровнями)5,8,9. Гетерогенность в синаптических цинка окрашивание, наблюдается в коре особенно выгодно, как она содействует идентификации площадной и слоистые.
Здесь мы представляем подробное описание синаптических цинка гистохимические процедуры, которая представляет собой модифицированную версию Danscher в 1982 году метод10. Этот метод использует селенит вводили внутрибрюшинно (IP) в животных как комплексон. Селенит едет в мозг реагировать с бассейнами свободной цинка, найденных в везикулы подмножество глутаматергические синапсов в головном мозге. Эта реакция дает осадок, который может впоследствии дополняться Серебряный развития2,10,11.
Эта процедура показывает ламинарное и площадных модели синаптической цинка окрашивания; денситометрических анализ может использоваться для оценки этих моделей как качественно, так и количественно в мозге взрослого и незрелых для изучения воздействия других мероприятий, таких как сенсорные, экологические, фармакологическим или генетических манипуляций. Кроме того один может потребоваться оценить потенциал развития изменения в распределении синаптических цинка в других корковых и подкорковых структур в других системах модель. Количественная информация, предоставляющий денситометрических анализ в этот метод может быть выгодным для развития мозга со временем. Этот протокол обеспечивает компаньон для других иммуно – и гистохимических маркеры раскрыть ламинарное и площадных границ.
Protocol
Representative Results
Discussion
Настоящее исследование использует гистохимический метод, основанный на модифицированную версию Danscher (1982) метод10, whereby синаптических цинка локализации могут быть обнаружены и визуализирована в головном мозге. Этот метод по сути работает путем инъекций животное с цинка сел…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана субсидии от национального центра для исследования ресурсов (2G12RR03060-26A1); Национальный институт здоровья меньшинств и неравенства в области здравоохранения (8G12MD007603-27) от национальных институтов здоровья; Профессиональный персонал конгресс Сити университета Нью-Йорка (PSC-CUNY); и факультет исследований Грант (ФРГ II) американский университет в Шардже. Мы благодарим Видьясагар Sriramoju за представление нам этих методов.
Materials
| Euthasol (Euthanasia solution) | Henry Schein | 710101 | |
| Sodium selenite | Sigma-Aldrich | 214485 | |
| Ketamine (Ketaved) | Henry Schein | 48858 | 100 mg/ml injectables |
| Xylazine (Anased) | Henry Schein | 33198 | 100 mg/ml injectables |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Dilute to 4% |
| Gum arabic | Sigma-Aldrich | G9752-500G | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | C1909 | |
| Sodium citrate | Sigma-Aldrich | W302600 | |
| Hydroquinone | Sigma-Aldrich | H9003 | |
| Silver lactate | Sigma-Aldrich | 85210 | |
| Fish gelatine | Sigma-Aldrich | G7765 | |
| Cytochrome c | Sigma-Aldrich | C2506 | (Type III, from equine heart) |
| Catalse | Sigma-Aldrich | C10 | |
| Sucrose | Domino | ||
| Xylene | Fisher Scientific | X5P-1GAL | |
| Permount | Fisher Scientific | SP15-500 | |
| 100% Ethanol | Fisher Scientific | A406-20 | Used for dehydration prior to slide mounting |
| Coverslips | Brain Research Laboratories | #3660-1 | |
| Frosted unsubbed slides | Brain Research Laboratories | #3875-FR | |
| Microtome | American Optical Company | 860 | |
| Microscope | Olympus | BX-60 | |
| Adope Photoshop | Adobe Systems, San Jose, CA | To assemble images | |
| ImageJ | Free software can be downloaded at http://rsb.info.nih.gov/ij/ | For densometric measurements | |
| Plastic tray | Any standard plastic tray may be used | to immerse slides in developer solution | |
| Hot plate | Any standard hotplate may be used |
References
- Nakashima, A., Dyck, R. H. Zinc and cortical plasticity. Brain Res. Rev. 59, 347-373 (2009).
- Frederickson, C. J. Neurobiology of zinc and zinc-containing neurons. Int Rev Neurobiol. 31, 145-238 (1989).
- Beaulieu, C., Dyck, R., Cynader, M. Enrichment of glutamate in zinc-containing terminals of the cat visual cortex. NeuroReport. 3 (10), 861-864 (1992).
- Martinez-Guijarro, F. J., Soriano, E., Del Rio, J. A., Lopez-Garcia, C. Zinc-positive boutons in the cerebral cortex of lizards show glutamate immunoreactivity. J Neurocytol. 20 (10), 834-843 (1991).
- Dyck, R., Beaulieu, C., Cynader, M. Histochemical localization of synaptic zinc in the developing cat visual cortex. J Comp Neurol. 329 (1), 53-67 (1993).
- Garrett, B., Geneser, F. A., Slomianka, L. Distribution of acetylcholinesterase and zinc in the visual cortex of the mouse. Anat Embryol. (Berl). 184 (5), 461-468 (1991).
- Garrett, B., Osterballe, R., Slomianka, L., Geneser, F. A. Cytoarchitecture and staining for acetylcholinesterase and zinc in the visual cortex of the Parma wallaby (Macropus parma). Brain Behav Evol. 43 (3), 162-172 (1994).
- Dyck, R., Cynader, M. An interdigitated columnar mosaic of cytochrome oxidase, zinc, and neurotransmitter-related molecules in cat and monkey visual cortex. Proc. Natl. Acad. Sci. (90), 9066-9069 (1993).
- Land, P. W., Akhtar, N. D. Experience-dependent alteration of synaptic zinc in rat somatosensory barrel cortex. Somatosens Mot Res. 16 (2), 139-150 (1999).
- Danscher, G. Exogenous selenium in the brain: a histochemical technique for light and electron microscopic localization of catalytic selenium bonds. Histochemistry. 76, 281-293 (1982).
- Danscher, G., Howell, G., Perez-Clausell, J., Hertel, N. The dithizone, Timm’s sulphide silver and the selenium methods demonstrate a chelatable pool of zinc in CNS: a proton activation (PIXE) analysis of carbon tetrachloride extracts from rat brains and spinal cords intravitall treated with dithizone. Histochemistry. 83, 419-422 (1985).
- Gallyas, F. Silver staining of myelin by means of physical development. Neurol Res. 1 (2), 203-209 (1979).
- Wong-Riley, M. Changes in the visual system of monocularly sutured or enucleated cats demonstrable with cytochrome oxidase histochemistry. Brain Res. 171 (1), 11-28 (1979).
- Miró-Bernié, N., Ichinohe, N., Perez-Clausell, J., Rockland, K. S. Zinc-rich transient vertical modules in the rat retrosplenial cortex during postnatal development. J Neurosci. 138 (2), 523-535 (2006).
- Ichinohe, N., Rockland, K. S. Distribution of synaptic zinc in the macaque monkey amygdala. J Comp Neurol. 489 (2), 135-147 (2005).
- Innocenti, G. M., Manger, P. R., Masiello, I., Colin, I., Tettoni, L. Architecture and callosal connections of visual areas 17, 18, 19 and 21 in the ferret (Mustela putorius). Cereb Cortex. 12 (4), 411-422 (2002).
- Khalil, R., Levitt, J. B. Zinc histochemistry reveals circuit refinement and distinguishes visual areas in the developing ferret cerebral cortex. Brain Struct Funct. 218, 1293-1306 (2013).
- Manger, P. R., Masiello, I., Innocenti, G. M. Areal organization of the posterior parietal cortex of the ferret (Mustela putorius). Cereb Cortex. 12, 1280-1297 (2002).
- Wong, P., Kaas, J. H. Architectonic subdivisions of neocortex in the gray squirrel (Sciurus carolinensis.). The anatomical record. 291, 1301-1333 (2008).
- Land, P. W., Shamalla-Hannah, L. Experience-dependent plasticity of zinc-containing cortical circuits during a critical period of postnatal development. J Comp Neurol. 447 (1), 43-56 (2002).
- Czupryn, A., Skangiel-Kramska, J. Distribution of synaptic zinc in the developing mouse somatosensory barrel cortex. J Comp Neurol. 386, 652-660 (1997).
- Timm, F. Zur Histochemie der Schwermetalle. Das Sulfid-Silber-Verfahren. Dtsch Z ges gerichtl Med. 46, 706-711 (1958).
