Mapeamento simultâneo e quantificação de ribonucleotídeos no DNA mitocondrial humano

Summary

Aqui nós descrevemos um método passível de dosar simultaneamente e ribonucleotídeos mapa de todo o genoma em DNA altamente intacta na resolução de single-nucleotide, combinando a clivagem enzimática do DNA genômico com sua hidrólise alcalina e subsequente 5´-final sequenciamento.

Abstract

Abordagens estabelecidas para estimar o número de ribonucleotídeos presentes em um genoma são limitadas para a quantificação de ribonucleotídeos incorporados usando fragmentos de DNA sintéticos curtos ou plasmídeos como modelos e em seguida a extrapolação dos resultados para toda a genoma. Alternativamente, o número de ribonucleotídeos presentes em um genoma pode ser estimado usando gel alcalina ou os borrões do Sul. Mais recente na vivo abordagens empregam sequenciamento de próxima geração, permitindo o mapeamento de todo o genoma de ribonucleotídeos, fornecendo a posição e a identidade de ribonucleotídeos incorporados. No entanto, não permitem a quantificação do número de ribonucleotídeos que são incorporados em um genoma. Aqui descrevemos como simultaneamente mapear e quantificar o número de ribonucleotídeos incorporadas humana mitochondrial DNA na vivo por sequenciamento de próxima geração. Vamos usar DNA altamente intacta e introduzir quebras da cadeia dupla específico de sequência digerindo-a com uma endonuclease, posteriormente hidrólise de ribonucleotídeos incorporados com alcaloide. As extremidades geradas são ligadas com adaptadores e essas extremidades são sequenciadas em uma máquina de sequenciamento de nova geração. O número absoluto de ribonucleotídeos pode ser calculado como o número de leituras fora do site de reconhecimento por número médio de leituras no local de reconhecimento para a endonuclease específica de sequência. Este protocolo também pode ser utilizado para mapear e dosar cortes grátis no DNA e permite a adaptação mapear outras lesões do ADN que podem ser processados para 5´-OH pontas ou extremidades 5´-fosfato. Além disso, este método pode ser aplicado a qualquer organismo, dado que um genoma de referência adequada está disponível. Este protocolo, portanto, fornece uma ferramenta importante para estudar a replicação do DNA, processamento de 5´ final, danos ao DNA e reparação do DNA.

Introduction

Em uma célula eucariótica, a concentração de ribonucleotídeos (rNTPs) é muito maior do que a concentração de desoxirribonucleicos (dNTPs)¹. As polimerases de DNA discriminam ribonucleotídeos, mas esta discriminação não é perfeita e, como consequência, ribonucleotídeos em vez de deoxyribonucleotides podem ser incorporados em genomas durante a replicação do DNA. Ribonucleotídeos podem ser mais comuns não-canônicos nucleotídeos incorporados ao genoma². A maioria destes ribonucleotídeos é removida durante o amadurecimento de fragmento de Okazaki por reparo de excisão de iniciados ribonucleótido RNase H2 (RER) ou Topoisomerase 1 (revisto em referência³). Ribonucleotídeos que não podem ser removidos ficar estàvel incorporados no DNA^2,4 e podem afetá-lo de maneiras prejudiciais e benéficas (revistas em revista⁵). Além de ser capaz de agir como sinais positivos, por exemplo tipo de acasalamento alternar no Schizosaccharomyces pombe⁶ e marcando a sequência de DNA nascente durante a incompatibilidade de reparar (MMR)^7,8, ribonucleotídeos afetam o estrutura⁹ e estabilidade do DNA circundante devido ao grupo hidroxila-2´ de seus ribose¹⁰, resultando em replicative stress e genoma instabilidade¹¹. A abundância de ribonucleotídeos no DNA genômico (gDNA) e sua relevância na replicação e mecanismos de reparação, bem como as implicações para a estabilidade do genoma, dá razão para investigar a sua exacta ocorrência e a frequência de uma forma de todo o genoma.

Atividade RNase H2 não foi encontrada na mitocôndria humana e ribonucleotídeos são, portanto, não eficientemente removidos no DNA mitocondrial (mtDNA). Diversas vias estão envolvidas no fornecimento de nucleotídeos à mitocôndria humana e para investigar se distúrbios na piscina nucleotídica mitocondrial causam um número elevado de ribonucleotídeos no DNA mitocondrial humano, desenvolvemos um protocolo para mapear e quantificar Esses ribonucleotídeos no DNA mitocondrial humano isolado de fibroblastos, células HeLa e linhas de célula paciente¹².

A maioria das abordagens em vitro (revistas em revista¹³) para determinar a seletividade dos polymerases DNA contra rNTPs baseiam-se único ribonucleótido inserção ou primeira demão extensão experiências onde rNTPs concorrentes estão incluídos na reação mistura, permitindo a identificação ou quantificação relativa de incorporação ribonucleotídeo em breve modelos de DNA. Abordagens quantitativas em sequências curtas podem não refletir piscinas dNTP e rNTP em concentrações celulares e, portanto, fornecer insights sobre seletividade do polymerase, mas são de importância limitada sobre genomas toda. Tem sido demonstrado que a quantidade relativa de ribonucleotídeos incorporado durante a replicação de um modelo de DNA mais longo, como um plasmídeo, pode ser visualizada em um gel de sequenciamento usando radiolabeled dNTPs e hidrólise de DNA em um meio alcalino¹⁴. Além disso, foram analisado gDNA sobre os borrões do Sul após hidrólise alcalina, permitindo que a vertente específica de sondagem e determinação das taxas absolutas de ribonucleotídeo incorporação na vivo¹⁵. Essas abordagens permitem uma comparação relativa de frequência de incorporação mas não entregam nenhum insight sobre a posição ou a identidade de ribonucleotídeos os incorporado. Abordagens mais recentes para analisar o conteúdo de ribonucleotídeo no gDNA na vivo, como HydEn-Seq¹⁶, Ribose-Seq¹⁷, Pu-Seq¹⁸ou emRiboSeq¹⁹, aproveite dos ribonucleotídeos incorporados sensibilidade à alcalina ou tratamento de RNase H2, respectivamente e empregar o sequenciamento de próxima geração para identificar todo o genoma de ribonucleotídeos. Esses métodos não fornecer a introspecção a frequência absoluta de incorporação dos ribonucleotídeos detectados. Adicionando a etapa de clivagem enzimática específica de sequência para o protocolo de HydEn-seq, o método que aqui descrevemos convenientemente estende a informação adquirida com uma abordagem de sequenciamento, permitindo mapeamento simultâneo e quantificação de incorporado ribonucleotídeos¹². Este método é aplicável a praticamente qualquer organismo, dado que extratos de DNA altamente intactos podem ser gerados e um genoma de referência adequada está disponível. O método pode ser adaptado para dosar e determinar a localização de qualquer lesão que não pode ser digerida por uma nuclease e deixa um 5´-fosfato ou um fim de 5´-OH.

Para mapear e dosar ribonucleotídeos no DNA genômico, o método combina clivagem por uma endonuclease específica sequência e hidrólise alcalina, gerando 5´-fosfato termina em locais onde se encontra a sequência de reconhecimento específica para a endonuclease e 5´- OH termina em posições onde se localizavam ribonucleotídeos. Desde que as extremidades livres geradas são posteriormente ligadas com adaptadores e sequenciado usando sequenciamento de próxima geração, é de importância usar DNA altamente intacta e evitar a fragmentação aleatória durante a preparação de extração e biblioteca de DNA. Avaliar estas leituras normalizadas para as leituras dos locais de clivagem de endonuclease permite uma quantificação simultânea e mapeamento de ribonucleotídeos os detectado. 5´-extremidades livres são detectados em experimentos de controle onde a hidrólise alcalina de DNA é substituída pelo tratamento com KCl. Os dados adquiridos fornecem a introspecção do ribonucleotídeo localização e quantidade e permite análises em relação a frequência de conteúdos e incorporação de ribonucleotídeo.

Protocol

este protocolo é descrito na Figura 1 e inclui o isolamento de gDNA, digestão com enzimas de restrição para ser capaz de quantificar o número de ribonucleotídeos, tratamento com álcali para hidrolisar as ligações fosfodiéster de ribonucleotídeos incorporada a gDNA, fosforilação das extremidades livre 5´-OH, ssDNA ligadura dos adaptadores, segunda vertente de síntese e amplificação por PCR antes sequenciamento. 1. índice de Primers e adaptadores ARC49 obter, ARC140 oligonucleotides, ARC76/77, adaptador e ARC78-ARC107 as primeiras demão índice (ver tabela 1). Nota: Oligonucleotides devem ser purificado de HPLC. ARC76/77 são ordenados como duplex. Preparar 100 µM as soluções de cada oligonucleotide em tampão Tris-EDTA (TE) (consulte a Tabela de materiais) e armazenar a -20 ° C. Soluções de soluções de preparar 10 µM de ARC67/77 e 2 µM de primers ARC49 e índice diluindo em tampão de eluição (EB; consulte a Tabela de materiais). Loja a-20 ° C. 2. Crescimento e colheita de células células HeLa crescer em 70 mL Dulbecco ' s Modified Eagle Medium (DMEM) suplementado com 10% de soro bovino fetal em um balão de 250 mL Spinner em 37 ° C. Contar o número de células e coletar 5 x 10 6 células em um tubo de 50 mL, centrifugar por 5 min a 200 x g e descartar o sobrenadante. Lavar as células com 20 mL 1X PBS, centrifugar por 5 min a 200 x g e descartar o sobrenadante. Congelar as bolinhas a-20 ° C ou continuar com a purificação de DNA. 3. Purificação de DNA e quantificação purificar gDNA usando extração fenol-clorofórmio, conforme descrito abaixo. Ressuspender as células em 2 mL de tampão de lise (consulte a Tabela de materiais) e incube por 30 min a 42 ° C em um bloco de aquecimento. Cuidado: Lise contém componentes perigosos. Solução de SDS é irritante, Proteinase K é tóxico, irritante e sensibilização. Use roupas protetoras e luvas. Dividir a amostra em dois tubos de 2 mL e adicionar 1 volume (V) de álcool isoamílico-fenol-clorofórmio (25:24:1). Cuidado: O álcool isoamílico-fenol-clorofórmio é tóxicos, mutagênicos, corrosivos e perigosos para ambientes aquáticos. Use em uma coifa, usar roupas protetoras e luvas e descarte de resíduos especiais de fenol-clorofórmio. Mix por inversão para 30-60 s e centrifugar durante 5 min à 15.000 x g à temperatura ambiente. Nota: Fazer não vórtice DNA para evitar a introdução de quebras aleatórias, que iria distorcer os resultados. Transferir a fase aquosa, superior para um novo tubo de 2 mL e adicionar 1 V de álcool isoamílico-fenol-clorofórmio (25:24:1). Mix por inversão e centrifugar durante 5 min à 15.000 x g a 4 ° C. Transferir a fase aquosa, superior para um novo 2 mL tubo e adicionar 20 µ l NaCl (5 M) e 1 V de isopropanol frio. Atenção: O Isopropanol é inflamável, irritante e tóxico. Armazená-lo em um gabinete ventilado, usar roupas protetoras e luvas e mantê-lo afastado de chamas. Mix por inversão e incubar durante pelo menos 1 h a -20 ° C. Centrífuga por 20 min em 15.000 x g, 4 ° C e descartar sobrenadante. Pellet de DNA de lavagem com 200 µ l 70% álcool etílico frio, centrifugar por 20 min a 15.000 x g a 4 ° C e descartar o sobrenadante. Atenção: 70% de etanol é inflamável e irritante. Manter a solução de trabalho em-20 ° C, caso contrário loja no armário ventilado, roupas protetoras e luvas e mantê-lo afastado de chamas. Secar o sedimento de DNA à temperatura de 20-25 min. Pelotas de DNA dissolver em 100 µ l de TE do buffer e as amostras em um tubo do pool. Concentração de DNA dosar usando um reagente de quantificação de dsDNA de acordo com o fabricante ' s especificações (ver a Tabela de materiais). Nota: Usar um reagente de quantificação de dsDNA, como quantificação espectrofotométrica do DNA pode ser afectada por fenol residual. DNA loja a-20 ° C ou continuar com o tratamento de HincII. 4. Hidrólise alcalina e tratamento de HincII Digest 1 µ g de DNA em uma reação de mistura contendo 5 µ l 10x buffer 3.1, 1 µ l (10 U) HincII e livre de nuclease H 2 O, até um volume final de 50 µ l. Nota: Para conseguir condições óptimas para ligadura, segunda vertente de síntese e amplificação por PCR, pode ser necessário aumentar a quantidade de DNA de entrada se espera-se que o ADN contém um número muito baixo de ribonucleotídeos. Da mesma forma, pode ser necessário diminuir a entrada de DNA se o número de ribonucleotídeos é muito alto. Incubar durante 30 min a 37 ° C. HincII purificar tratados DNA com grânulos paramagnéticos. Nota: Mantenha o tubo tampas abrir nas etapas a seguir para não perturbar pelotas abrindo os tubos. Adicionar 1,8 V de grânulos paramagnéticos para cada amostra, misturar cuidadosamente pipetando e incubar à temperatura ambiente durante 10 min. Usar um rack magnético para granular os grânulos por 5 min, em seguida, remover e descartar o sobrenadante. Lavar a pelota com 150 µ l de etanol 70% (temperatura ambiente) para cerca de 30 s em seguida, remover e descartar o sobrenadante. Lavagem a pelota com 200 µ l de etanol 70% (temperatura ambiente) por cerca de 30 s, então, remover e descartar o sobrenadante. Nota: Etanol Residual pode ser removido com uma pipeta de 10 µ l. As gotas podem ser giradas para baixo brevemente antes. Secar as amostras em temperatura ambiente por cerca de 15-20 min. Nota: O tempo exato depende do volume dos grânulos e a forma da pelota, portanto, as pastilhas devem ser verificadas visualmente. Remover tubos de rack magnético e eluir a pelota em µ l 45 EB, mistura pipetando cuidadosamente. Incubar por 5 min então granular os grânulos no rack magnético e use 45 µ l de DNA purificado na etapa 4.4. Adicionar 5 µ l de KOH (3 M) ou KCl (3 M) com o DNA criando um volume total de 50 µ l. Cuidado: solução de KOH M 3 é corrosivo. Use roupas protetoras e luvas. Forno de incubar durante 2 h a 55 ° C em uma hibridação seguido por 5 min no gelo Nota: Recomenda-se realizar o tratamento de KOH em um forno, ao invés de um bloco de aquecimento para manter um aquecimento uniforme do tubo e impedir a condensação na tampa. DNA precipitado pela adição de acetato de sódio 10 µ l (3 M, pH = 5,2) e 125 µ l 100% álcool etílico frio. Incubar no gelo por 5 min. Atenção: 100% de etanol é inflamável e irritante. Armazenar em um gabinete ventilado, usar roupas protetoras e luvas e manter afastado de chamas. GDNA de pelotas por centrifugação a 21.000 x g, 4 ° C por 5 min e descartar o sobrenadante. Lavagem DNA pelota com 250 µ l frio 70% EtOH, centrifugar a 21.000 x g, 4 ° C por 5 min e descartar o sobrenadante. Nota: Para remover as gotas, o tubo pode ser girado para baixo, brevemente novamente e sobrenadante pode ser removido com uma pipeta de 10 µ l. Deixar o sedimento secar em um tubo aberto por cerca de 5-10 min até visível todo o líquido tenha evaporado. DNA deixa pelota dissolvê-los em 20 µ l EB por 30 min à temperatura ambiente. 5. 5´ final fosforilação preparar a mistura de reação para cada amostra antecipadamente contrasome de 2,5 µ l 10 x T4 amortecedor da reação da quinase polinucleotídicas, 1 µ l (10 U) 3´-fosfatase-menos T4 polinucleotídicas da quinase e 2,5 µ l ATP (10 mM). Transferência 19 µ l de cada DNA para um novo tubo de 200 µ l da amostra e desnaturar por 3 min a 85 ° C em um thermo-cycler. Cool DNA amostras no gelo e adicione 6 µ l da mistura de reação para cada amostra. Mistura de reação de incubar a 37 ° C por 30 min e parar a reação incubando-se as amostras a 65 ° C por 20 min. Purificar DNA como descrito no ponto 4.3, usando 1.8 V dos grânulos paramagnéticos mas eluir em µ l 14 EB. 6. ssDNA ligadura preparar a mistura de reação para cada amostra antecipadamente consistindo de 0.5 µ l ATP (2 mM), 5 µ l 10 x amortecedor da reação do RNA T4 ligase, 5 µ l CoCl 3 (NH 3) 6 (10 mM), 0,5 µ l ARC140 (100 µM) e 25% de 50 µ l PEG 8000. Mistura bem pipetando. Atenção: CoCl 3 (NH 3) 6 é cancerígeno, sensibilização e perigosas para o ambiente aquático. Use roupas protetoras e luvas. Transferência 13 µ l de DNA purificado de passo 5.5 para um novo tubo de 200 µ l e desnaturar por 3 min a 85 ° C em um thermo-cycler. Legal o DNA no gelo e adicione 36 µ l da mistura de reação para cada amostra, misturar pipetando spin para baixo brevemente. Adicionar 1 µ l (10 U) de T4 Ligase de RNA para cada reação, misturar pipetando e spin para baixo brevemente. Incubar as amostras à temperatura ambiente na noite escura. 7. Síntese segundo-Costa Purify ligado DNA, conforme descrito no ponto 4.3, mas usar 0,8 V de grânulos paramagnéticos, granular os grânulos por 10 min e eluir em 20 µ l EB. Nota: Devido à maior viscosidade da mistura de reação da ligadura, a primeira etapa de granulação é prolongada. Transferência de 20 µ l de amostra de DNA para um novo tubo de PCR de 200 µ l. Repita a etapa de purificação usando 0.8 V de grânulos paramagnéticos seguindo o fabricante ' s especificações e eluir em µ l 14 EB. Preparar a mistura de reação para cada amostra antecipadamente consistindo de 2 µ l de 10 x T7 DNA polimerase amortecedor da reação, 2 µ l ARC76/77 (2 µM), 2 µ l dNTPs (2 mM) e 0,8 µ l BSA (1 mg/mL). µ L 12,8 transferir purificado DNA para um novo tubo de 200 µ l, desnaturar por 3 min a 85 ° C em um thermo-cycler. Legal o DNA no gelo e adicionar 6,8 µ l da mistura de reação de cada amostra, misturar pipetando, spin para baixo rapidamente e incubar durante 5 min à temperatura ambiente. Adicionar 0,4 µ l (4 U) T7 DNA polimerase para cada reação e incubar durante 5 min à temperatura ambiente. Purificar DNA como descrito no ponto 4.3, usando 0.8 V de grânulos paramagnéticos e eluir em 11 µ l EB. 8. Amplificação por PCR e quantificação da biblioteca tubo de Prepare a mistura de reação para cada amostra em um novo 200 µ l antecipadamente consistindo de 7,5 µ l ARC49 (2 µM), primeira demão de índice 7,5 µ l (2 µM, exclusivo para cada amostra) e 25 µ l 2 x começo quente mistura pronta. Adicionar 10 µ l de amostra de DNA para cada reação. Amplificar a biblioteca usando as seguintes condições: desnaturar a 95 ° C por 45 s, seguido de 18 ciclos de 98 ° C por 15 s, 65 ° C por 30 s, 72 ° C por 30 s, terminando com um alongamento final a 72 ° C para amostras de espera de 2 min. a 4 ° C após amplificação. Purificar bibliotecas conforme descrito no ponto 4.3, usando 0.8 V de grânulos paramagnéticos e eluir no buffer de TE 20 µ l. Dosar bibliotecas usando um reagente de quantificação de dsDNA, de acordo com o fabricante ' s especificações (ver a Tabela de materiais). Armazenar amostras a-20 º C ou continuar com a análise de biblioteca. 9. Análise de biblioteca e de determinar a qualidade de cada biblioteca e estimar o tamanho do fragmento média usando um sistema de eletroforese digital. Nota: O tamanho do fragmento média é avaliado pela estimativa onde a área sob a curva da electroferograma é reduzido a metade, desconsiderando a picos de marcadores. Resultados representativos dos perfis de biblioteca apropriada após tratamento KOH ou KCl são dadas na Figura 2A. Calcular a concentração (nM) das bibliotecas como: /(p*650) (c/10 3)] * 10 9 onde c é a concentração da biblioteca em ng / µ l e p é o tamanho do fragmento média na bp, como estimado em 9.1. Piscina molares quantidades iguais de até 24 bibliotecas amplificadas com primers de índice diferente para sequenciamento. Adicionar tampão TE para um volume final de 25 µ l e concentração de 10 nM. Nota: Dependendo do número de bibliotecas seja agrupado, é ajustar a quantidade de DNA de cada biblioteca. Se dímeros cartilha foram detectados na etapa 9.1 como um distinto pico de cerca de 130 bp, o volume final da biblioteca piscina pode exceder 25 µ l, porque a etapa de purificação é repetida, conforme descrito no ponto 4.3, usando 0.8 V de grânulos paramagnéticos, e DNA é eluída em 25 µ l TE buf Fer. Determinar a concentração de piscina nova biblioteca usando um reagente de quantificação de dsDNA de acordo com o fabricante ' s especificações e a média de pico tamanho conforme descrito acima. Prossiga para sequenciamento e análise de dados (capítulo 10 e 11). 10. Sequenciamento de realizar 75-base emparelhado-final sequenciamento em bibliotecas em pool 12. 11. análise de dados Trim todas as leituras para remover sequências de adaptador, filtro para qualidade e leia o comprimento. Nota: Isto pode ser feito usando cutadapt 1.2.1 20 com o comando ‘ cutadapt -f fastq – jogo-leitura-curingas – silêncio – 15 m – q 10 – um NNNNNNN < arquivo >’, onde NNNNNNN é substituído com a sequência de adaptador real e < arquivo > é substituído com o nome do arquivo fastq. Remover companheiros de leituras que foram descartados no passo anterior usando scripts personalizados. Pares de alinhar o companheiro 1 do restante a um índice que contém a sequência de todos os oligonucleotídeos utilizados para a preparação de biblioteca (por exemplo, usando Bowtie 0.12.8 21 e a linha de comando opções – m1-v2). Elimine todos os pares com alinhamentos bem sucedidos. Alinhar pares restantes para o genoma de referência de organismo usando gravata borboleta com a linha de comando opções – v2 -X 10000..–melhor. Mapa lê esse intervalo entre a molécula mitocondrial começo e fim, alinhando 1 companheiro de todos os pares desalinhados (usando gravata borboleta com a linha de comando opções – v2). Determinar a contagem de fins-de-5´ para todos os alinhamentos de fim único e emparelhados. Mude a posição destes por um base montante para a posição onde estavam os hidrolisado ribonucleotídeos. Dados de exportação do arquivo bowtie formato em um formato de arquivo de bedgraph usando scripts personalizados para visualização em comum navegadores do genoma. Normalizar as leituras para cada vertente de leituras por milhões. Usando a posição e contagens do arquivo bedgraph, referência a sequência genômica do organismo, para determinar a identidade do incorpditado ribonucleotídeos. Nota: Para o genoma mitocondrial humano lê das regiões 16.200-300 e 5.747-5.847 para cada vertente deve ser excluído desde que estas regiões contêm muitos 5´-extremidades livres, não relacionados à incorporação ribonucleótido pela DNA polimerase γ. Dividir o lê total, não incluindo leituras dos onze locais de HincII, com o número médio de leituras por HincII site para obter o número de ribonucleotídeos por intervalo único filamento, (ou seja, o número de ribonucleotídeos por molécula mitocondrial).

Representative Results

Ilustrando a metodologia descritos acima, representativos de dados foram gerados, analisando o DNA mitocondrial humano HeLa células12. Figura 2B mostra as leituras resumidas em todos os sites HincII em pesados (HS) e fio de luz (LS) de DNA mitocondrial humano após tratamento de KCl (painéis à esquerda). Aproximadamente 70% de todos os fins-de-5´ detectados localizar para os corte-sites, demonstrando a alta eficiência da digestão HincII. Tratamento de bibliotecas com KOH para hidrolisar o ADN ribonucleotídeos incorporados diminui o número de leituras em sites HincII para cerca de 40% (Figura 2B, painéis certo). Isto é esperado desde que um grande número de fins-de-5´ é gerado aos sítios de incorporação ribonucleotídeo e é indicativo de uma qualidade suficiente da biblioteca. Figura 2 ilustra a localização e a frequência de fins-de-5´ (verde) após leituras e tratamento de KCl geraram por HydEn-seq (magenta) após o tratamento de KOH, detectar tanto 5´-extremidades livres e extremidades geradas no ribonucleotídeos por hidrólise alcalina. 5´-extremidades livres e ribonucleotídeos localizando o SH de DNA mitocondrial humano são mostrados no painel da esquerda e aqueles localizando para o LS são mostradas no painel direito. Os números relativos de leituras crus em ribonucleotídeos (Figura 2D, painel superior) ou sites de HincII (painel inferior) em HS e LS do mtDNA mostram, respectivamente, uma cobertura mais forte 14-fold ou 31-fold do LS em relação a HS, enquanto um viés semelhante não foi observado para DNA nuclear. Este viés de vertente podem ser explicada pela diferença na composição de base das duas vertentes distinta e ilustra a importância da normalização para leituras em sites HincII. Normalizando a leitura conta para HincII dá uma medida quantitativa do número de ribonucleotídeos por genoma mitocondrial (Figura 3A). Conforme ilustrado na Figura 3B, as leituras após tratamento de KOH para cada ribonucleótido normalizado para a composição de sequência de cada vertente mostram uma relação diferente de 1, indicando uma distribuição não aleatória de leituras sugerindo um ribonucleótido distinto padrão e uma qualidade elevada de biblioteca. Essa proporção é afetada pela digestão anterior com HincII, verificar a especificidade de clivagem da enzima. Normalizar as leituras aos sítios de ribonucleotídeos incorporados aos sítios de clivagem de HincII, bem como o conteúdo de nucleotídeos do genoma, gera uma medida quantitativa de quantos de cada ribonucleótido são incorporados por 1.000 bases complementares ( Figura 3). Figura 1: esquemático para processamento de DNA e biblioteca preparação. (1) DNA genômico todo é clivado pela HincII para normalização na quantificação subsequente de ribonucleotídeos, gerando extremidades sem corte em HincII locais (seta preta). (2) o DNA é tratado com KOH para hidrolisar em sites ribonucleotídeo, levando a 2´, 3´-cíclico fosfato (Pentágono vermelho) em fins-de-3´ e 5´-OH livre termina. (3) 5´-OH extremidades são fosforiladas por T4 polinucleotídicas quinase 3´-fosfatase-subtração. (4) todos os fins-de-5´ um grupo de fosfato são ligados para do oligonucleotide ARC140 pela ligase do RNA do T4. (5) a segunda vertente é sintetizado usando T7 DNA polimerase e os oligonucleotides ARC76-77 contendo sequências de6 N aleatórias. (6) a biblioteca é amplificada por um Polymerase de ADN de alta-fidelidade usando ARC49 e um do ARC78 de ARC107 primeiras demão de índice que contém um único código de barras para multiplexação. (7) 5´-extremidades estão localizados por sequenciamento emparelhado-final. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2: validação do método. (A) electropherograms representante gerado usando um sistema automatizado de electroforese para determinar a qualidade do gerado bibliotecas tratadas com KOH ou resumidos KCl. (B) sinal em locais HincII pesado (HS) e luz strand (LS) DNA mitocondrial humano depois de KCl (painéis esquerdos) ou tratamento de KOH (painéis de certo). (C) Circos figura de 5´-extremidades livres (verde) e de HydEn-Seq (5´-extremidades livres e ribonucleotídeos, magenta) no HS (painel esquerdo) e o DNA mitocondrial humano LS (painel direito). Picos são normalizados por milhões leituras e o pico máximo é ajustado para o máximo número de leituras da biblioteca HydEn-seq. (D) resumidos cru lê ribonucleotídeos (painel superior) e sites de HincII (painel inferior) em pesados (H) e fio de luz (L) no DNA mitocondrial humano (Mito.) ou no sentido inverso (RV) ou para a frente (FW) costa, no nuclear (Nuc). DNA. Figuras B, C e D são adaptadas de referência12. Barras de erro representam o erro padrão da média. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3: resultados do representante. (A), o relativo número de ribonucleotídeos normalizada para leituras em HincII locais para bibliotecas KOH tratado no fio de luz (L) ou pesados (H). (B) relação de identidade ribonucleótido para composição de genoma de DNA mitocondrial para KOH tratados (KOH) e HincII clivado com KOH Tratado (HincII + KOH) bibliotecas no pesado (H) ou luz (L) fio de DNA mitocondrial. (C) frequência ribonucleótido normalizada para 1.000 bases complementares por HincII e KOH tratados bibliotecas no pesado (H) ou fio de luz (L) de DNA mitocondrial. Figuras são adaptadas de referência12. Barras de erro representam o erro padrão da média. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Nome Sequência de ARC49 AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT ARC76 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTNNNN * N * N ARC77 AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTC * A * C ARC78 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT ARC84 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACATCGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT ARC85 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCCTAAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT ARC86 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGGTCAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT ARC87 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCACTGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT ARC88 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATTGGCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT ARC89 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGATCTGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT ARC90 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCAAGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT ARC91 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTGATCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT ARC93 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAAGCTAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT ARC94 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTAGCCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT ARC95 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTACAAGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT ARC96 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGTTGACTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT ARC97 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACGGAACTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT ARC98 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCTGACATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT ARC99 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGGACGGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT ARC100 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTGCGGACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT ARC101 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTTTCACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT ARC102 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAAGGCCACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT ARC103 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCCGAAACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT ARC104 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTACGTACGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT ARC105 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATCCACTCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT ARC106 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATATCAGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT ARC107 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAAAGGAATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT ARC140 / 5AmMC6/ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT Tabela 1: Oligonucleotides. Estão listados os oligonucleotides usados para HydEn-Seq. Negrito indica a indexação. * indica um vínculo phosphorothioate. ARC140 contém um grupo amino-5´ em vez de um grupo de 5´-OH, em combinação com um vinculador de C6. Esta alteração reduz a formação de concatemers ARC140 durante a ligadura.

Discussion

Aqui apresentamos uma técnica para mapear e quantificar ribonucleotídeos em gDNA e DNA mitocondrial, em particular, pela simples introdução de clivagem de DNA em locais específicos de sequência no genoma como um complemento para o protocolo de HydEn-seq estabelecido simultaneamente. Enquanto este estudo centra-se no DNA mitocondrial humano, originalmente, o método de HydEn-seq foi desenvolvido em Saccharomyces cerevisiae, ilustrando a tradução do método para outros organismos^12,16.

Para confiáveis resultados obtidos com esta abordagem, devem notar-se alguns passos importantes: (A) desde que adaptadores de sequenciamento ligam para todos os fins-de-5´ disponíveis, é fundamental trabalhar com DNA altamente intacta. DNA deve ser isolado e bibliotecas devem ser feitas de preferência imediatamente após o isolamento do DNA, ou o DNA pode ser armazenado a-20 ° C. Não é recomendável armazenar DNA na geladeira por muito tempo ou para congelar e descongelar repetidamente. (B) para gerar bibliotecas adequadas com este método, é crucial realizar o tratamento de KOH do DNA em um forno de incubação, ao invés de um bloco de aquecimento, garantindo o aquecimento homogêneo da amostra inteira e hidrólise quantitativa. (C) Além disso, é fundamental para controlar a qualidade das bibliotecas antes de pool e sequenciamento. O DNA devem ser quantificadas e analisadas usando um sistema automatizado de eletroforese para assegurar quantidades adequadas de biblioteca de DNA, confirmar tamanhos apropriados do fragmento e verifique dímeros da primeira demão.

Para uma análise de dados significativos, também é importante notar que o valor informativo desse método é dependente de controles apropriados para avaliar fundo contagens e sequência ou vertente de preconceitos. Nós rotineiramente atingir uma eficiência de mapeamento em amostras de KCl de cerca de 70% quando apenas digerindo com a endonuclease específica sequência (Figura 2B, painéis à esquerda). Além disso, é importante confirmar que o tratamento de endonuclease não está afetando o total detecção de ribonucleotídeos incorporados, comparando HincII tratada e não tratada amostras (Figura 3B). Nesses experimentos, usamos HincII apresentar cortes de local específico, embora outras enzimas de restrição de alta-fidelidade também poderia ser usadas.

O protocolo pode ser adaptado estudar outros tipos de lesões do ADN que podem ser processados para 5´-fosfato ou 5´-OH termina. A precisão dos resultados depende da especificidade do processamento e requer controles adequados (por exemplo, o tipo selvagem ou não tratada) para verificação. Além disso, quando adaptar esse método para outros aplicativos ou para uso com outros organismos, deve-se considerar que o método em sua configuração atual requer cerca de 1 µ g de DNA que é processado em uma biblioteca. Desde que o número de extremidades é dependente do número de ribonucleotídeos incorporados, que varia de acordo com o organismo ou mutante, amostras, incluindo um número menor de ribonucleotídeos exigiria mais entrada de DNA para gerar um número suficiente de extremidades na construção de biblioteca subsequentes. Da mesma forma, se as amostras de DNA têm um número muito maior de ribonucleotídeos, também exigiria usando menos entrada de DNA para obter condições óptimas para ligadura, segunda vertente de síntese e amplificação por PCR. Vale ressaltar que a construção de biblioteca, conforme descrito neste protocolo também gerou dados cobrindo o genoma nuclear (conforme exibido na Figura 2D) e somente a análise de dados centrou-se no DNA mitocondrial. Isso ilustra que genomas maiores com frequências ribonucleótido moderadamente baixas também são capturadas por esse método.

Ao considerar este método, certas limitações devem ser consideradas: embora este método deve, em teoria, ser aplicável a virtualmente qualquer organismo, um genoma de referência adequada é necessário para o alinhamento de leituras. Além disso, os resultados obtidos do nosso protocolo representam as leituras de um grande número de células. Padrões de incorporação ribonucleótido específicas de um subconjunto de células não podem ser identificados por esta abordagem. Se ribonucleotídeos são mapeados em genomas maiores com um número muito baixo de ribonucleotídeos, pode ser um desafio para discriminar ribonucleotídeos de nicks aleatórios e controlos adequados, portanto, são necessários.

O método que descrevemos aqui, estende as técnicas disponíveis na vivo como HydEn-Seq¹⁶, Ribose-Seq¹⁷, Pu-Seq¹⁸ou emRiboSeq¹⁹. Essas abordagens aproveitar-se da sensibilidade dos ribonucleotídeos incorporado à alcalina ou tratamento de RNase H2, respectivamente, empregando sequenciamento de próxima geração para identificar ribonucleotídeos todo o genoma, que permite o mapeamento e comparação de incorporação de relativa. Por fendendo a sequência do DNA, especificamente, como descrito acima, além de hidrólise alcalina a ribonucleotídeos incorporados, o lê para ribonucleotídeos pode ser normalizado para esses sites de clivagem, que permite não só a identificação e o mapeamento de ribonucleotídeos, mas também sua quantificação para cada molécula de DNA. A aplicação da nossa técnica no contexto das doenças relacionadas com a replicação do DNA, reparo do DNA e TLS poderia fornecer uma compreensão mais profunda do papel de ribonucleotídeos no subjacente mecanismos moleculares e a integridade do genoma em geral.

Materials

10x T4 Polynucleotide Kinase Reaction Buffer	New England Biolabs	B0201S
10x T4 RNA Ligase Reaction Buffer	New England Biolabs	B0216L
1x PBS	Medicago	09-9400-100	dissolve 1 tablet in H2O to a final volume of 1 L
2-Propanol	Sigma-Aldrich	33539-1L-GL-R
2100 Bioanalyzer	Agilent Technologies	G2940CA
50 mL Centrifuge Tube	VWR	525-0610
Adenosine 5'-Triphosphate (ATP, 10 mM)	New England Biolabs	P0756S	dilute with EB to 2 mM
Agilent DNA 1000 Kit	Agilent Technologies	5067-1504
BSA, Molecular Biology Grade (20 mg/mL)	New England Biolabs	B9000S	diltue with nuclease-free H2O to 1 mg/mL
Buffer EB	QIAGEN	19086	referred to as EB
CleanPCR paramagnetic beads	CleanNA	CPCR-0050
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix (10 mM each)	New England Biolabs	N0447L	dilute with EB to 2 mM
DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement	Gibco	61965026
DynaMag 96 Side	Thermo Fisher	12331D
Ethanol 99.5% analytical grade	Solveco	1395	dilute with milliQ water to 70%
Ethylenediaminetetraacetic acid solution (EDTA, 0.5 M)	Sigma-Aldrich	03690-100ML
Fetal bovine serum	Gibco	10500056
HEPES buffer pH 8.0 (1 M) sterile BC	AppliChem	A6906,0125
Hexammine cobalt(III) chloride (CoCl3(NH3)6)	Sigma-Aldrich	H7891-5G	dissolve in nuclease-free H2O for 10 M solution, sterile filter. CAUTION: carcinogenic, sensitizing and hazardous to aquatic environment.
HincII	New England Biolabs	R0103S	supplied with NEBuffer 3.1
Hybridiser HB-1D	Techne	FHB4DD
KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X)	Kapa Biosystems	KK2602
Lysis buffer			50 mM EDTA, 20 mM HEPES, NaCl 75 mM, Proteinase K (200 µg/mL), 1% SDS
Micro tube 1.5 mL	Sarstedt	72.690.001
Microcentrifuge 5424R	Eppendorf	5404000014
Microcentrifuge MiniStar silverline	VWR	521-2844
Multiply µStripPro 0.2 mL tube	Sarstedt	72.991.992
Nuclease-free water	Ambion	AM9937
Phenol – chloroform – isoamyl alcohol (25:24:1)	Sigma-Aldrich	77617-500ML
Potassium chloride (KCl)	VWR	26764.232	dissolve in nuclease-free H2O for 3 M solution, sterile filter
Potassium hydroxide (KOH)	VWR	26668.296	dissolve in nuclease-free H2O for 3 M solution, sterile filter
Proteinase K	Ambion	AM2546
Qubit 3.0 Fluorometer	Invitrogen	Q33216
Qubit Assay Tubes	Invitrogen	Q32856
Qubit dsDNA BR Assay Kit	Invitrogen	Q32850	CAUTION: Contains flammable and toxic components
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Invitrogen	Q32851	CAUTION: Contains flammable and toxic components
Refrigerated Centrifuge 4K15	Sigma Laboratory Centrifuges	No. 10740
SDS Solution, 10%	Invitrogen	15553-035
Sodium acetate buffer solution, pH 5.2, 3 M (NaAc)	Sigma-Aldrich	S7899
Sodium chloride (NaCl)	VWR	27810.295	dissolve in nuclease-free H2O for 5 M solution, sterile filter
T100 Thermal Cycler	Bio-Rad	1861096
T4 Polynucleotide Kinase (3' phosphatase minus)	New England Biolabs	M0236L
T4 RNA Ligase 1 (ssRNA Ligase)	New England Biolabs	M0204L	supplied with PEG 8000 (50%)
T7 DNA Polymerase (unmodified)	New England Biolabs	M0274S	supplied with 10x T7 DNA Polymerase Reaction Buffer
TE Buffer	Invitrogen	12090015
ThermoMixer F2.0	Eppendorf	5387000013