Visualisering af Thalamocortical Axon forgrening og Synapse dannelse i Organotypic Cocultures
Summary
Denne protokol beskriver en metode til samtidige billeddannelse af thalamocortical axon forgrening og synapse dannelse i organotypic cocultures af thalamus og hjernebarken. Enkelte thalamocortical axoner og deres præsynaptiske terminaler er visualiseret ved en enkelt celle elektroporation teknik med DsRed og normal god landbrugspraksis-mærket synaptophysin.
Abstract
Axon forgrening og synapse dannelse er afgørende processer til at fastsætte præcise neuronal kredsløb. Under udvikling danner sensoriske thalamocortical (TC) axoner grene og synapser i særlige lag af hjernebarken. Trods åbenlyse rumlige korrelationen mellem axon forgrening og synapse dannelse, er årsagssammenhængen mellem dem dårligt forstået. For at løse dette problem, udviklet vi for nylig en metode til samtidige billeddannelse af forgrening og synapse dannelsen af individuelle TC axoner i organotypic cocultures.
Denne protokol beskriver en metode, som består af en kombination af en organotypic coculture og elektroporation. Organotypic cocultures af thalamus og hjernebarken lette genmanipulation og observation af cytoskeletale processer, bevare karakteristiske strukturer såsom laminar konfiguration. To særskilte plasmider kodning DsRed og EGFP-mærket synaptophysin (SYP-EGFP) var Co transfected ind i et lille antal thalamic neuroner ved en elektroporation teknik. Denne metode tillod os at visualisere individuelle cytoskeletale morfologier TC neuroner og deres præsynaptiske sites samtidigt. Metoden også aktiveret langsigtet observation, som afslørede årsagssammenhængen mellem axon forgrening og synapse dannelse.
Introduction
Thalamocortical (TC) projektion i pattedyr hjernen er et egnet system til at undersøge axon vejledning og målretning mekanismer. Under udvikling vokse sensoriske TC axoner i kortikale plade, og form grene og synapser fortrinsvis i lag IV af de primære sensoriske områder i hjernebarken1,2. Selv efter oprettelsen af grundlæggende forbindelser, er cytoskeletale Dorne og synaptiske terminalerne ombygget afhængigt af miljømæssige ændringer3,4. Men hvordan TC axon morfologi ændres dynamisk er dårligt forstået. En af hovedårsagerne er manglen på en passende teknik til at observere strukturelle ændringer på en enkelt celle niveau. Selv om den seneste udvikling i mikroskopi, såsom to-foton mikroskopi, har tilladt direkte observation af levende kortikale neuroner i vivo, er der stadig tekniske begrænsninger til at indfange den samlede TC baner5, 6. derfor, in vitro- metoder til live imaging af TC axoner ville give kraftfulde værktøjer for strukturelle analyser af axon forgrening og synapse dannelse.
Vores gruppe for første gang fastsat en statisk skive kultur metode med permeabel membran7. Brug denne metode, en rotte kortikale skive var cocultured med en sensoriske thalamic blok, og lamina-specifikke TC forbindelser blev sammenfattet i denne organotypic cocultures7,8. Sparsomme mærkning med en fluorescerende proteiner yderligere tillod os at observere TC axon vækst og gren dannelse9,10,11. For nylig, har vi udviklet en roman metode for samtidige billeddannelse af filialer og synapse dannelsen af individuelle TC axoner i organotypic cocultures12. For at visualisere TC axoner og præsynaptiske sites samtidigt, var DsRed og EGFP-mærket synaptophysin (SYP-EGFP) Co transfected ind i et lille antal thalamic neuroner ved elektroporation af organotypic coculture. Den nuværende metode letter morfologisk analyse af TC axoner og tillader langsigtet observation, som kan bruges til at vise årsagssammenhængen mellem axon forgrening og synapse dannelse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den nuværende protokol er også et kraftfuldt værktøj til at studere udviklingsmæssige aspekter af voksende axoner end TC projektion11. For eksempel, en kombination af kortikale skive kultur og elektroporation teknik giver mulighed for visualisering individuelle cytoskeletale morfologi af kortikale neuroner og langsigtet observation9,18.
Ved hjælp af den nuværende protokol, kan roller af interessante gener…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker også Gabriel hånd for kritisk læsning.
Materials
| DMEM/F12 | GIBCO | 11320-033 | |
| Hanks’ balanced salt solution (HBSS) | Nissui | 5905 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Scientific | SH30396-03 | Hyclone |
| Insulin | Sigma | I6634 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888 | |
| Sodium selenite | Wako Pure Chemical Industries |
192-10843 | |
| Transferrin | Sigma | T1147 | |
| Putrescine | Sigma | P5780 | |
| Glucose | Wako Pure Chemical Industries |
16806-25 | |
| 35 mm petri dishes | Falcon | 351008 | |
| Millicell-CM insert | Millipore | PICMORG50 | |
| 100 mm petri dishes | BIO-BIK | I-90-20 | petri dish sterrile |
| HiPure Plasmid Maxiprep Kit | Invitrogen | K210006 | |
| Disposable sterile plastic pipettes | 202-IS | transfer pipets sterile | |
| Glass capillary: OD 1.2 mm | Narishige | G-1.2 | inner diameter, 1.2 mm |
| Silver wire: 0.2 and 1 mm | Nilaco | AG-401265 (diameter, 0.2 mm), AG-401485 (diameter, 1.0 mm) | |
| 1 mL syringe | Terumo | SS-01T | |
| Stimulator | A.M.P.I | Master 8 | |
| Biphasic isolator | BAK ELECTRONICS | BSI-2 | |
| Amplifier | A-M Systems | Model 1800 | |
| Oscilloscope | Hitachi | VC-6723 | |
| Manipulator | Narishige | SM-15 | |
| Micromanipulator | Narishige | MO-10 | |
| Stereomicroscope | Olympus | SZ40 | |
| Universal stand | Olympus | SZ-STU2 | |
| Light illumination system | Olympus | LG-PS2, LG-DI, HLL301 | |
| Electrode puller | Narishige | PC-10 | |
| Confocal microscope | Nikon | Digital eclipse C1 laser | |
| x20 objective | Nikon | ELWD 20x/0.45 | |
| Culture chamber | Tokai Hit | UK A16-U | |
| Sprague-Dawley (SD) rat | Japan SLC and Nihon-Dobutsu | ||
| Microsurgery scissors | Natsume | MB-54-1 |
References
- Kageyama, G. H., Robertson, R. T. Development of geniculocortical projections to visual cortex in rat: evidence early ingrowth and synaptogenesis. J. Comp. Neurol. 335 (1), 123-148 (1993).
- Lopez-Bendito, G., Molnar, Z. Thalamocortical development: how are we going to get there. Nat. Rev. Neurosci. 4 (4), 276-289 (2003).
- Espinosa, J. S., Stryker, M. P. Development and plasticity of the primary visual cortex. Neuron. 75 (2), 230-249 (2012).
- Portera-Cailliau, C., Weimer, R. M., De Paola, V., Caroni, P., Svoboda, K. Diverse modes of axon elaboration in the developing neocortex. PLoS Biol. 3 (8), 272 (2005).
- Holtmaat, A., Svoboda, K. Experience-dependent structural synaptic plasticity in the mammalian brain. Nat. Rev. Neurosci. 10 (9), 647-658 (2009).
- Bhatt, D. H., Zhang, S., Gan, W. B. Dendritic spine dynamics. Annu Rev Physiol. 71, 261-282 (2009).
- Yamamoto, N., Kurotani, T., Toyama, K. Neural connections between the lateral geniculate nucleus and visual cortex in vitro. Science. 245 (4914), 192-194 (1989).
- Yamamoto, N., Yamada, K., Kurotani, T., Toyama, K. Laminar specificity of extrinsic cortical connections studied in coculture preparations. Neuron. 9 (2), 217-228 (1992).
- Uesaka, N., Hirai, S., Maruyama, T., Ruthazer, E. S., Yamamoto, N. Activity dependence of cortical axon branch formation: a morphological and electrophysiological study using organotypic slice cultures. J. Neurosci. 25 (1), 1-9 (2005).
- Uesaka, N., Hayano, Y., Yamada, A., Yamamoto, N. Interplay between laminar specificity and activity-dependent mechanisms of thalamocortical axon branching. J. Neurosci. 27 (19), 5215-5223 (2007).
- Uesaka, N., Nishiwaki, M., Yamamoto, N. Single cell electroporation method for axon tracing in cultured slices. Dev. Growth Differ. 50 (6), 475-477 (2008).
- Matsumoto, N., Hoshiko, M., Sugo, N., Fukazawa, Y., Yamamoto, N. Synapse-dependent and independent mechanisms of thalamocortical axon branching are regulated by neuronal activity. Dev Neurobiol. 76 (3), 323-336 (2016).
- Matsumoto, N., Sasaki, K., Yamamoto, N. Electroporation Method for Mammalian CNS Neurons in Organotypic Slice Cultures. Electroporation Methods in Neuroscience. , 159-168 (2015).
- Molnar, Z., Blakemore, C. Lack of regional specificity for connections formed between thalamus and cortex in coculture. Nature. 351 (6326), 475-477 (1991).
- Bolz, J., Novak, N., Staiger, V. Formation of specific afferent connections in organotypic slice cultures from rat visual cortex cocultured with lateral geniculate nucleus. J. Neurosci. 12 (8), 3054-3070 (1992).
- Yamamoto, N., et al. Inhibitory mechanism by polysialic acid for lamina-specific branch formation of thalamocortical axons. J. Neurosci. 20 (24), 9145-9151 (2000).
- Yamamoto, N., et al. Characterization of factors regulating lamina-specific growth of thalamocortical axons. J Neurobiol. 42 (1), 56-68 (2000).
- Ohnami, S., et al. Role of RhoA in activity-dependent cortical axon branching. J. Neurosci. 28 (37), 9117-9121 (2008).
- Yamada, A., et al. Role of pre- and postsynaptic activity in thalamocortical axon branching. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (16), 7562-7567 (2010).
