Visualisation de Thalamocortical Axon Branching et Synapse Formation chez organotypique Cocultures
Summary
Ce protocole décrit une méthode pour l’imagerie simultanée de thalamocortical axon branching et synapse formation dans cocultures organotypique du thalamus et le cortex cérébral. Les axones thalamocortical individuels et leurs terminaisons présynaptiques sont visualisés par une technique d’électroporation monocellulaires avec DsRed et synaptophysine GFP-étiquetée.
Abstract
Axon branching et synapse formation sont des processus cruciales pour l’établissement des circuits neuronaux précises. Au cours du développement, axones sensoriels thalamocortical (TC) forment des branches et des synapses dans des calques spécifiques du cortex cérébral. Malgré l’évidente corrélation spatiale entre la formation d’axon branching et synapse, le lien de causalité entre eux est mal compris. Pour résoudre ce problème, nous avons récemment mis au point une méthode d’imagerie simultanée de ramification et synapse formation des axones TC individuels organotypique cocultures.
Ce protocole décrit une méthode qui consiste en une combinaison d’une co-culture organotypique et électroporation. Cocultures organotypique du thalamus et le cortex cérébral facilitent la manipulation génétique et l’observation des processus axonales, préservant les structures caractéristiques telles que la configuration laminaire. Deux plasmides distincts codant DsRed et EGFP-tag synaptophysine (SYP-EGFP) ont été conjointement transfectées dans un petit nombre de neurones thalamiques par une technique d’électroporation. Cette méthode nous a permis de visualiser individuels morphologies axones des neurones de TC et leurs sites présynaptiques simultanément. La méthode a également permis d’observation à long terme, qui a révélé le lien de causalité entre la formation d’axon branching et synapse.
Introduction
La projection de thalamocortical (TC) dans le cerveau des mammifères est un système adéquat d’enquêter sur le guidage axonal et ciblage des mécanismes. Au cours du développement, les axones sensoriels de TC poussent dans la plaque corticale et les branches de la forme et les synapses préférentiellement en couche IV des aires sensorielles primaires dans le cortex cérébral1,2. Même après la mise en place de connexions fondamentales, tonnelles axonales et terminaux synaptiques est remodelés selon les changements environnementaux3,4. Cependant, comment la morphologie axon TC est dynamiquement modifiée est mal comprise. Une des principales raisons est le manque d’une technique adéquate pour observer les changements structurels au niveau unicellulaire. Bien que les développements récents en microscopie, telles que la microscopie biphotonique, ont permis l’observation directe de la vie les neurones corticaux en vivo, il y a des limites encore techniques pour capturer le général TC trajectoires5, 6. par conséquent, méthodes in vitro pour l’imagerie direct des axones TC fournirait des outils puissants pour les analyses structurelles d’axon branching et synapse formation.
Notre groupe pour la première fois mis en place une méthode de culture statique tranche avec membrane perméable7. En utilisant cette méthode, une tranche de cortex de rat a été co-cultivées avec un bloc thalamique sensoriel et connexions TC lamina spécifiques ont été récapitulées dans ce organotypique cocultures7,8. Étiquetage clairsemée avec une protéine fluorescente plus loin nous a permis d’observer la croissance axonale TC et la direction générale de la formation9,10,11. Récemment, nous avons développé une méthode originale pour l’imagerie simultanée de la ramification et la formation des synapses des axones de TC individuels dans l’organotypique cocultures12. Afin de visualiser simultanément les axones de TC et sites présynaptiques, DsRed et EGFP-tag synaptophysine (SYP-EGFP) ont été conjointement transfectées dans un petit nombre de neurones thalamiques par électroporation de la co-culture organotypique. La méthode actuelle facilite l’analyse morphologique des axones de TC et permet l’observation à long terme, qui peut être utilisée pour montrer la relation de causalité entre la formation d’axon branching et synapse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole actuel est également un outil puissant pour étudier les aspects liés au développement de la croissance des axones autrement que de la projection de TC11. Par exemple, une combinaison de la culture de la tranche corticale et la technique d’électroporation permet de visualiser chaque morphologie axonale des neurones corticaux et à long terme d’observation9,18.
En utilisant le protocole actue…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions également Gabriel Hand lecture critique.
Materials
| DMEM/F12 | GIBCO | 11320-033 | |
| Hanks’ balanced salt solution (HBSS) | Nissui | 5905 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Scientific | SH30396-03 | Hyclone |
| Insulin | Sigma | I6634 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888 | |
| Sodium selenite | Wako Pure Chemical Industries |
192-10843 | |
| Transferrin | Sigma | T1147 | |
| Putrescine | Sigma | P5780 | |
| Glucose | Wako Pure Chemical Industries |
16806-25 | |
| 35 mm petri dishes | Falcon | 351008 | |
| Millicell-CM insert | Millipore | PICMORG50 | |
| 100 mm petri dishes | BIO-BIK | I-90-20 | petri dish sterrile |
| HiPure Plasmid Maxiprep Kit | Invitrogen | K210006 | |
| Disposable sterile plastic pipettes | 202-IS | transfer pipets sterile | |
| Glass capillary: OD 1.2 mm | Narishige | G-1.2 | inner diameter, 1.2 mm |
| Silver wire: 0.2 and 1 mm | Nilaco | AG-401265 (diameter, 0.2 mm), AG-401485 (diameter, 1.0 mm) | |
| 1 mL syringe | Terumo | SS-01T | |
| Stimulator | A.M.P.I | Master 8 | |
| Biphasic isolator | BAK ELECTRONICS | BSI-2 | |
| Amplifier | A-M Systems | Model 1800 | |
| Oscilloscope | Hitachi | VC-6723 | |
| Manipulator | Narishige | SM-15 | |
| Micromanipulator | Narishige | MO-10 | |
| Stereomicroscope | Olympus | SZ40 | |
| Universal stand | Olympus | SZ-STU2 | |
| Light illumination system | Olympus | LG-PS2, LG-DI, HLL301 | |
| Electrode puller | Narishige | PC-10 | |
| Confocal microscope | Nikon | Digital eclipse C1 laser | |
| x20 objective | Nikon | ELWD 20x/0.45 | |
| Culture chamber | Tokai Hit | UK A16-U | |
| Sprague-Dawley (SD) rat | Japan SLC and Nihon-Dobutsu | ||
| Microsurgery scissors | Natsume | MB-54-1 |
References
- Kageyama, G. H., Robertson, R. T. Development of geniculocortical projections to visual cortex in rat: evidence early ingrowth and synaptogenesis. J. Comp. Neurol. 335 (1), 123-148 (1993).
- Lopez-Bendito, G., Molnar, Z. Thalamocortical development: how are we going to get there. Nat. Rev. Neurosci. 4 (4), 276-289 (2003).
- Espinosa, J. S., Stryker, M. P. Development and plasticity of the primary visual cortex. Neuron. 75 (2), 230-249 (2012).
- Portera-Cailliau, C., Weimer, R. M., De Paola, V., Caroni, P., Svoboda, K. Diverse modes of axon elaboration in the developing neocortex. PLoS Biol. 3 (8), 272 (2005).
- Holtmaat, A., Svoboda, K. Experience-dependent structural synaptic plasticity in the mammalian brain. Nat. Rev. Neurosci. 10 (9), 647-658 (2009).
- Bhatt, D. H., Zhang, S., Gan, W. B. Dendritic spine dynamics. Annu Rev Physiol. 71, 261-282 (2009).
- Yamamoto, N., Kurotani, T., Toyama, K. Neural connections between the lateral geniculate nucleus and visual cortex in vitro. Science. 245 (4914), 192-194 (1989).
- Yamamoto, N., Yamada, K., Kurotani, T., Toyama, K. Laminar specificity of extrinsic cortical connections studied in coculture preparations. Neuron. 9 (2), 217-228 (1992).
- Uesaka, N., Hirai, S., Maruyama, T., Ruthazer, E. S., Yamamoto, N. Activity dependence of cortical axon branch formation: a morphological and electrophysiological study using organotypic slice cultures. J. Neurosci. 25 (1), 1-9 (2005).
- Uesaka, N., Hayano, Y., Yamada, A., Yamamoto, N. Interplay between laminar specificity and activity-dependent mechanisms of thalamocortical axon branching. J. Neurosci. 27 (19), 5215-5223 (2007).
- Uesaka, N., Nishiwaki, M., Yamamoto, N. Single cell electroporation method for axon tracing in cultured slices. Dev. Growth Differ. 50 (6), 475-477 (2008).
- Matsumoto, N., Hoshiko, M., Sugo, N., Fukazawa, Y., Yamamoto, N. Synapse-dependent and independent mechanisms of thalamocortical axon branching are regulated by neuronal activity. Dev Neurobiol. 76 (3), 323-336 (2016).
- Matsumoto, N., Sasaki, K., Yamamoto, N. Electroporation Method for Mammalian CNS Neurons in Organotypic Slice Cultures. Electroporation Methods in Neuroscience. , 159-168 (2015).
- Molnar, Z., Blakemore, C. Lack of regional specificity for connections formed between thalamus and cortex in coculture. Nature. 351 (6326), 475-477 (1991).
- Bolz, J., Novak, N., Staiger, V. Formation of specific afferent connections in organotypic slice cultures from rat visual cortex cocultured with lateral geniculate nucleus. J. Neurosci. 12 (8), 3054-3070 (1992).
- Yamamoto, N., et al. Inhibitory mechanism by polysialic acid for lamina-specific branch formation of thalamocortical axons. J. Neurosci. 20 (24), 9145-9151 (2000).
- Yamamoto, N., et al. Characterization of factors regulating lamina-specific growth of thalamocortical axons. J Neurobiol. 42 (1), 56-68 (2000).
- Ohnami, S., et al. Role of RhoA in activity-dependent cortical axon branching. J. Neurosci. 28 (37), 9117-9121 (2008).
- Yamada, A., et al. Role of pre- and postsynaptic activity in thalamocortical axon branching. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (16), 7562-7567 (2010).
