Visualizzazione di Thalamocortical Axon ramificazione e Synapse formazione in Cocultures organotipiche
Summary
Questo protocollo descrive un metodo per l’acquisizione simultanea delle thalamocortical assone ramificazione e sinapsi formazione in organotipiche cocultures del talamo e corteccia cerebrale. Thalamocortical singoli assoni e loro terminali presinaptici sono visualizzati mediante una tecnica di elettroporazione di singola cellula con DsRed e lo synaptophysin GFP-etichettato.
Abstract
Formazione di ramificazione e sinapsi dell’assone sono processi cruciali per stabilire precisi circuiti neuronali. Durante lo sviluppo, gli assoni sensoriali thalamocortical (TC) formano rami e sinapsi in livelli specifici della corteccia cerebrale. Nonostante l’evidente correlazione spaziale tra formazione di ramificazione e sinapsi dell’assone, la relazione causale tra di loro è capita male. Per risolvere questo problema, abbiamo recentemente sviluppato un metodo per l’acquisizione simultanea delle formazione ramificazione e sinapsi dei singoli assoni di TC in cocultures organotipiche.
Questo protocollo descrive un metodo che consiste di una combinazione di un coculture organotipiche e l’elettroporazione. Organotipiche cocultures del talamo e corteccia cerebrale facilitare la manipolazione del gene e l’osservazione dei processi di axonal, preservando le strutture caratteristiche come configurazione laminare. Due plasmidi distinti codifica DsRed e lo synaptophysin EGFP-etichetta (SYP-EGFP) sono state co-trasfettate in un piccolo numero di neuroni talamici da una tecnica di elettroporazione. Questo metodo ci ha permesso di visualizzare singole axonal morfologie dei neuroni di TC e loro siti presinaptici simultaneamente. Il metodo attivato anche l’osservazione a lungo termine che ha rivelato il rapporto causale fra formazione di ramificazione e sinapsi dell’assone.
Introduction
La proiezione di thalamocortical (TC) nel cervello dei mammiferi è un sistema adatto per studiare assone di orientamento e di meccanismi di targeting. Durante lo sviluppo, assoni sensoriali TC crescono nella placca corticale e rami di forma e sinapsi preferenzialmente in strato IV delle aree sensoriali primarie in corteccia cerebrale1,2. Anche dopo l’istituzione di collegamenti fondamentali, pergolati assonale e terminali sinaptici sono state rimodernate a seconda dei cambiamenti ambientali3,4. Tuttavia, come la morfologia dell’assone TC dinamicamente è alterata è capita male. Uno dei motivi principali è la mancanza di un’adeguata tecnica di osservare i cambiamenti strutturali a livello di singola cellula. Anche se recenti sviluppi nella microscopia, come il microscopio a due fotoni, hanno permesso l’osservazione diretta dei neuroni corticali vivente in vivo, non ci sono limitazioni ancora tecniche per catturare il generale TC traiettorie5, 6. Pertanto, metodi in vitro per l’imaging dal vivo degli assoni TC sarebbero forniscono potenti strumenti per le analisi strutturali della formazione di ramificazione e sinapsi dell’assone.
Il nostro gruppo per la prima volta stabilito un metodo di coltura slice statico con membrana permeabile7. Utilizzando questo metodo, una fetta di corticali del ratto è stato cocultured con un blocco sensoriale talamico e connessioni TC della lamina specifiche erano ricapitolate in questo organotipiche cocultures7,8. Etichettatura di tipo sparse con una proteina fluorescente ulteriormente ci ha permesso di osservare la crescita assonale TC e ramo formazione9,10,11. Recentemente, abbiamo sviluppato un nuovo metodo per la rappresentazione simultanea di ramificazione e formazione di sinapsi di singoli assoni di TC nell’organotipiche cocultures12. Per visualizzare contemporaneamente TC assoni e siti presinaptici, DsRed e lo synaptophysin EGFP-etichetta (SYP-EGFP) erano co-trasfettate in un piccolo numero di neuroni talamici mediante elettroporazione del coculture organotipiche. Il metodo corrente facilita l’analisi morfologica degli assoni di TC e permette per l’osservazione a lungo termine, che può essere utilizzato per mostrare la relazione causale tra formazione di ramificazione e sinapsi dell’assone.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo attuale è anche un potente strumento per studiare aspetti inerenti allo sviluppo della crescita assoni diversi da quelli dei TC proiezione11. Per esempio, una combinazione di cultura corticale fetta e la tecnica di elettroporazione consente di visualizzare singola axonal morfologia dei neuroni corticali e a lungo termine osservazione9,18.
Utilizzando il protocollo attuale, i ruoli dei geni interes…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo anche Gabriel Hand per lettura critica.
Materials
| DMEM/F12 | GIBCO | 11320-033 | |
| Hanks’ balanced salt solution (HBSS) | Nissui | 5905 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Scientific | SH30396-03 | Hyclone |
| Insulin | Sigma | I6634 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888 | |
| Sodium selenite | Wako Pure Chemical Industries |
192-10843 | |
| Transferrin | Sigma | T1147 | |
| Putrescine | Sigma | P5780 | |
| Glucose | Wako Pure Chemical Industries |
16806-25 | |
| 35 mm petri dishes | Falcon | 351008 | |
| Millicell-CM insert | Millipore | PICMORG50 | |
| 100 mm petri dishes | BIO-BIK | I-90-20 | petri dish sterrile |
| HiPure Plasmid Maxiprep Kit | Invitrogen | K210006 | |
| Disposable sterile plastic pipettes | 202-IS | transfer pipets sterile | |
| Glass capillary: OD 1.2 mm | Narishige | G-1.2 | inner diameter, 1.2 mm |
| Silver wire: 0.2 and 1 mm | Nilaco | AG-401265 (diameter, 0.2 mm), AG-401485 (diameter, 1.0 mm) | |
| 1 mL syringe | Terumo | SS-01T | |
| Stimulator | A.M.P.I | Master 8 | |
| Biphasic isolator | BAK ELECTRONICS | BSI-2 | |
| Amplifier | A-M Systems | Model 1800 | |
| Oscilloscope | Hitachi | VC-6723 | |
| Manipulator | Narishige | SM-15 | |
| Micromanipulator | Narishige | MO-10 | |
| Stereomicroscope | Olympus | SZ40 | |
| Universal stand | Olympus | SZ-STU2 | |
| Light illumination system | Olympus | LG-PS2, LG-DI, HLL301 | |
| Electrode puller | Narishige | PC-10 | |
| Confocal microscope | Nikon | Digital eclipse C1 laser | |
| x20 objective | Nikon | ELWD 20x/0.45 | |
| Culture chamber | Tokai Hit | UK A16-U | |
| Sprague-Dawley (SD) rat | Japan SLC and Nihon-Dobutsu | ||
| Microsurgery scissors | Natsume | MB-54-1 |
References
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