Visualisering av Thalamocortical Axon forgrening og Synapse formasjon i Organotypic Cocultures
Summary
Denne protokollen beskriver en metode for samtidige bildebehandling thalamocortical axon forgrening og synapse formasjonen i organotypic cocultures av thalamus og hjernebarken. Personlige thalamocortical axons og deres presynaptic terminaler er visualisert ved en enkelt celle electroporation teknikk med DsRed og GFP-merket synaptophysin.
Abstract
Axon forgrening og synapse formasjon er avgjørende prosesser for å etablere presis nevrale kretser. Under utvikling danner sensoriske thalamocortical (TC) axons grener og synapser i bestemte lag i hjernebarken. Til tross for åpenbare romlige sammenhengen mellom axon forgrening og synapse formasjon, er årsakssammenheng mellom dem dårlig forstått. For å løse dette problemet, utviklet vi nylig en metode for samtidige avbilding av forgrening og synapse dannelsen av personlige TC axons i organotypic cocultures.
Denne protokollen beskriver en metode som består av en kombinasjon av en organotypic coculture og electroporation. Organotypic cocultures thalamus og hjernebarken lette genet manipulasjon og observasjon av axonal prosesser, bevare karakteristiske strukturer som laminær konfigurasjon. To forskjellige plasmider koding DsRed og EGFP-merket synaptophysin (SYP-EGFP) var co transfekterte i et lite antall thalamic neurons ved en teknikk for electroporation. Denne metoden tillot oss å visualisere personlige axonal morphologies TC neurons og deres presynaptic nettsteder samtidig. Metoden også aktivert langsiktige observasjon som viste årsakssammenheng mellom axon forgrening og synapse formasjon.
Introduction
Thalamocortical (TC) projeksjon i pattedyr hjernen er en passende å undersøke axon veiledning og målretting mekanismer. Utvikling vokse sensoriske TC axons i kortikale plate, og skjemaet grener og synapser fortrinnsvis i lag IV av sensoriske hovedområdene i hjernebarken1,2. Selv etter etableringen av grunnleggende tilkoblinger, er axonal arbors og synaptic terminaler remodeled avhengig av miljøendringer3,4. Men er hvordan TC axon morfologi endres dynamisk dårlig forstått. En av hovedgrunnene er mangelen på en tilstrekkelig teknikk å observere strukturelle endringer på en enkelt celle-nivå. Selv om den siste utviklingen i mikroskopi, for eksempel to-fotonet mikroskopi, har tillatt direkte observasjon av levende kortikale nevroner i vivo, er det fortsatt tekniske begrensninger for å fange den samlede TC baner5, 6. derfor i vitro metoder for live bildebehandling av TC axons ville gi kraftige verktøy for strukturelle analyser av axon forgrening og synapse formasjon.
Vår gruppe for første gang etablert en statisk skive kultur metode med gjennomtrengelig membran7. Bruker denne metoden, en rotte kortikale skive ble cocultured med en sensorisk thalamic blokk, og lamina-spesifikke TC tilkoblinger var recapitulated i denne organotypic cocultures7,8. Sparsom merking med et fluorescerende protein ytterligere tillatt oss å observere TC axon vekst og gren formasjon9,10,11. Nylig har vi utviklet en ny metode for samtidige avbilding av forgrening og synapse dannelsen av personlige TC axons i organotypic cocultures12. For å visualisere TC axons og presynaptic områder samtidig, var DsRed og EGFP-merket synaptophysin (SYP-EGFP) co transfekterte i et lite antall thalamic neurons ved electroporation av organotypic coculture. Det aktuelle metoden muliggjør morfologisk analyse av TC axons og gir langsiktig observasjon, som kan brukes til å vise årsakssammenheng mellom axon forgrening og synapse formasjon.
Protocol
Representative Results
Discussion
Gjeldende protokollen er også et kraftig verktøy for å studere utviklingsmessige aspekter av voksende axons enn TC projeksjon11. For eksempel kan en kombinasjon av kortikale skive kultur og electroporation teknikken visualisere personlige axonal morfologi av kortikale nevroner og langsiktig observasjon9,18.
Ved hjelp av gjeldende protokollen, kan rollene interessant gener i axon forgrening og synapse formasjo…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker også Gabriel hånd for kritisk lesing.
Materials
| DMEM/F12 | GIBCO | 11320-033 | |
| Hanks’ balanced salt solution (HBSS) | Nissui | 5905 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Scientific | SH30396-03 | Hyclone |
| Insulin | Sigma | I6634 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888 | |
| Sodium selenite | Wako Pure Chemical Industries |
192-10843 | |
| Transferrin | Sigma | T1147 | |
| Putrescine | Sigma | P5780 | |
| Glucose | Wako Pure Chemical Industries |
16806-25 | |
| 35 mm petri dishes | Falcon | 351008 | |
| Millicell-CM insert | Millipore | PICMORG50 | |
| 100 mm petri dishes | BIO-BIK | I-90-20 | petri dish sterrile |
| HiPure Plasmid Maxiprep Kit | Invitrogen | K210006 | |
| Disposable sterile plastic pipettes | 202-IS | transfer pipets sterile | |
| Glass capillary: OD 1.2 mm | Narishige | G-1.2 | inner diameter, 1.2 mm |
| Silver wire: 0.2 and 1 mm | Nilaco | AG-401265 (diameter, 0.2 mm), AG-401485 (diameter, 1.0 mm) | |
| 1 mL syringe | Terumo | SS-01T | |
| Stimulator | A.M.P.I | Master 8 | |
| Biphasic isolator | BAK ELECTRONICS | BSI-2 | |
| Amplifier | A-M Systems | Model 1800 | |
| Oscilloscope | Hitachi | VC-6723 | |
| Manipulator | Narishige | SM-15 | |
| Micromanipulator | Narishige | MO-10 | |
| Stereomicroscope | Olympus | SZ40 | |
| Universal stand | Olympus | SZ-STU2 | |
| Light illumination system | Olympus | LG-PS2, LG-DI, HLL301 | |
| Electrode puller | Narishige | PC-10 | |
| Confocal microscope | Nikon | Digital eclipse C1 laser | |
| x20 objective | Nikon | ELWD 20x/0.45 | |
| Culture chamber | Tokai Hit | UK A16-U | |
| Sprague-Dawley (SD) rat | Japan SLC and Nihon-Dobutsu | ||
| Microsurgery scissors | Natsume | MB-54-1 |
References
- Kageyama, G. H., Robertson, R. T. Development of geniculocortical projections to visual cortex in rat: evidence early ingrowth and synaptogenesis. J. Comp. Neurol. 335 (1), 123-148 (1993).
- Lopez-Bendito, G., Molnar, Z. Thalamocortical development: how are we going to get there. Nat. Rev. Neurosci. 4 (4), 276-289 (2003).
- Espinosa, J. S., Stryker, M. P. Development and plasticity of the primary visual cortex. Neuron. 75 (2), 230-249 (2012).
- Portera-Cailliau, C., Weimer, R. M., De Paola, V., Caroni, P., Svoboda, K. Diverse modes of axon elaboration in the developing neocortex. PLoS Biol. 3 (8), 272 (2005).
- Holtmaat, A., Svoboda, K. Experience-dependent structural synaptic plasticity in the mammalian brain. Nat. Rev. Neurosci. 10 (9), 647-658 (2009).
- Bhatt, D. H., Zhang, S., Gan, W. B. Dendritic spine dynamics. Annu Rev Physiol. 71, 261-282 (2009).
- Yamamoto, N., Kurotani, T., Toyama, K. Neural connections between the lateral geniculate nucleus and visual cortex in vitro. Science. 245 (4914), 192-194 (1989).
- Yamamoto, N., Yamada, K., Kurotani, T., Toyama, K. Laminar specificity of extrinsic cortical connections studied in coculture preparations. Neuron. 9 (2), 217-228 (1992).
- Uesaka, N., Hirai, S., Maruyama, T., Ruthazer, E. S., Yamamoto, N. Activity dependence of cortical axon branch formation: a morphological and electrophysiological study using organotypic slice cultures. J. Neurosci. 25 (1), 1-9 (2005).
- Uesaka, N., Hayano, Y., Yamada, A., Yamamoto, N. Interplay between laminar specificity and activity-dependent mechanisms of thalamocortical axon branching. J. Neurosci. 27 (19), 5215-5223 (2007).
- Uesaka, N., Nishiwaki, M., Yamamoto, N. Single cell electroporation method for axon tracing in cultured slices. Dev. Growth Differ. 50 (6), 475-477 (2008).
- Matsumoto, N., Hoshiko, M., Sugo, N., Fukazawa, Y., Yamamoto, N. Synapse-dependent and independent mechanisms of thalamocortical axon branching are regulated by neuronal activity. Dev Neurobiol. 76 (3), 323-336 (2016).
- Matsumoto, N., Sasaki, K., Yamamoto, N. Electroporation Method for Mammalian CNS Neurons in Organotypic Slice Cultures. Electroporation Methods in Neuroscience. , 159-168 (2015).
- Molnar, Z., Blakemore, C. Lack of regional specificity for connections formed between thalamus and cortex in coculture. Nature. 351 (6326), 475-477 (1991).
- Bolz, J., Novak, N., Staiger, V. Formation of specific afferent connections in organotypic slice cultures from rat visual cortex cocultured with lateral geniculate nucleus. J. Neurosci. 12 (8), 3054-3070 (1992).
- Yamamoto, N., et al. Inhibitory mechanism by polysialic acid for lamina-specific branch formation of thalamocortical axons. J. Neurosci. 20 (24), 9145-9151 (2000).
- Yamamoto, N., et al. Characterization of factors regulating lamina-specific growth of thalamocortical axons. J Neurobiol. 42 (1), 56-68 (2000).
- Ohnami, S., et al. Role of RhoA in activity-dependent cortical axon branching. J. Neurosci. 28 (37), 9117-9121 (2008).
- Yamada, A., et al. Role of pre- and postsynaptic activity in thalamocortical axon branching. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (16), 7562-7567 (2010).
