Визуализация Thalamocortical аксона ветвления и синапса формирования в Organotypic Cocultures
Summary
Этот протокол описывает метод для одновременной обработки изображений thalamocortical аксона ветвления и СИНАПС формирования в organotypic cocultures таламуса и коры головного мозга. Аксоны отдельных thalamocortical и их Пресинаптический терминалы визуализируются путем электропорации техника одной ячейки с DsRed и synaptophysin GFP-тегами.
Abstract
Аксон ветвления и СИНАПС формирования являются важнейших процессов для установления точных нейронных цепей. Во время разработки сенсорные thalamocortical (TC) аксоны составляют филиалов и синапсы в определенных слоях коры головного мозга. Несмотря на очевидные пространственной корреляции между аксона ветвления и СИНАПС формирования плохо понимается причинно-следственной связи между ними. Для решения этой проблемы, мы недавно разработали метод для одновременной обработки изображений ветвления и СИНАПС формирования отдельных TC аксоны в organotypic cocultures.
Этот протокол описывает метод, который состоит из комбинации organotypic coculture и электропорации. Organotypic cocultures таламуса и коре облегчить генные манипуляции и наблюдения аксональное процессов, сохраняя характерные структуры, такие как ламинарная конфигурации. Два отдельных плазмид, кодировки DsRed и EGFP-меткой synaptophysin (SYP-EGFP) были совместно transfected в небольшое количество таламуса нейронов, метод электропорации. Этот метод позволил нам визуализировать отдельных аксональное морфологии TC нейронов и их Пресинаптический сайтов одновременно. Метод позволяет также долгосрочное наблюдение, который выявил причинную связь между аксона ветвления и СИНАПС формирования.
Introduction
Thalamocortical (TC) проекция в мозге млекопитающих является подходящей системы расследовать аксона руководства и ориентации механизмов. Во время разработки сенсорные TC аксоны растут в корковых плита и форма ветвей и синапсы преференциально в слой IV первичных сенсорных областей в коре1,2. Даже после установления основных соединений аксональное беседки и синаптическую терминалы перестроенный в зависимости от изменений окружающей среды3,4. Однако плохо понимается как TC аксона морфология динамически изменяется. Одна из главных причин является отсутствие надлежащей техники соблюдать структурных изменений на уровне отдельной ячейки. Хотя недавние события в микроскопии, например два Фотон микроскопии, позволили прямого наблюдения о жизни корковых нейронов в естественных условиях, есть еще технические ограничения для захвата общей ТК траектории5, 6. Таким образом, в пробирке методы для живых изображений TC аксонов обеспечит мощные инструменты для структурного анализа аксона ветвления и СИНАПС формирования.
Наша группа впервые создан метод культуры статический фрагмент с проницаемой мембраны7. С помощью этого метода, кусочек коры головного мозга крыс было cocultured с блоком сенсорные таламуса и пластинки конкретных TC соединения были сведены воедино в этой organotypic cocultures7,,8. Разреженные маркировки с флуоресцентный белок далее позволил нам наблюдать за ростом аксона TC и филиал формирование9,10,11. Недавно мы разработали новый метод для одновременного отображения ветвления и формирования синапсов отдельных TC аксоны в organotypic cocultures12. Чтобы визуализировать TC аксонов и Пресинаптический сайтов одновременно, совместно transfected в небольшое количество таламуса нейронов путем электропорации organotypic coculture DsRed и EGFP-меткой synaptophysin (SYP-EGFP). Текущий метод облегчает морфологический анализ TC аксонов и позволяет для долгосрочного наблюдения, который может использоваться для отображения причинная связь между аксона ветвления и СИНАПС формирования.
Protocol
Representative Results
Discussion
Текущий протокол является также мощным инструментом для изучения аспектов развития роста аксонов не проекции TC11. Например сочетание корковых ломтик культуры и метод электропорации позволяет визуализации отдельных аксональное морфология корковых нейронов и долгосрочны…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы также благодарим Габриэль руку для критических чтении.
Materials
| DMEM/F12 | GIBCO | 11320-033 | |
| Hanks’ balanced salt solution (HBSS) | Nissui | 5905 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Scientific | SH30396-03 | Hyclone |
| Insulin | Sigma | I6634 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888 | |
| Sodium selenite | Wako Pure Chemical Industries |
192-10843 | |
| Transferrin | Sigma | T1147 | |
| Putrescine | Sigma | P5780 | |
| Glucose | Wako Pure Chemical Industries |
16806-25 | |
| 35 mm petri dishes | Falcon | 351008 | |
| Millicell-CM insert | Millipore | PICMORG50 | |
| 100 mm petri dishes | BIO-BIK | I-90-20 | petri dish sterrile |
| HiPure Plasmid Maxiprep Kit | Invitrogen | K210006 | |
| Disposable sterile plastic pipettes | 202-IS | transfer pipets sterile | |
| Glass capillary: OD 1.2 mm | Narishige | G-1.2 | inner diameter, 1.2 mm |
| Silver wire: 0.2 and 1 mm | Nilaco | AG-401265 (diameter, 0.2 mm), AG-401485 (diameter, 1.0 mm) | |
| 1 mL syringe | Terumo | SS-01T | |
| Stimulator | A.M.P.I | Master 8 | |
| Biphasic isolator | BAK ELECTRONICS | BSI-2 | |
| Amplifier | A-M Systems | Model 1800 | |
| Oscilloscope | Hitachi | VC-6723 | |
| Manipulator | Narishige | SM-15 | |
| Micromanipulator | Narishige | MO-10 | |
| Stereomicroscope | Olympus | SZ40 | |
| Universal stand | Olympus | SZ-STU2 | |
| Light illumination system | Olympus | LG-PS2, LG-DI, HLL301 | |
| Electrode puller | Narishige | PC-10 | |
| Confocal microscope | Nikon | Digital eclipse C1 laser | |
| x20 objective | Nikon | ELWD 20x/0.45 | |
| Culture chamber | Tokai Hit | UK A16-U | |
| Sprague-Dawley (SD) rat | Japan SLC and Nihon-Dobutsu | ||
| Microsurgery scissors | Natsume | MB-54-1 |
References
- Kageyama, G. H., Robertson, R. T. Development of geniculocortical projections to visual cortex in rat: evidence early ingrowth and synaptogenesis. J. Comp. Neurol. 335 (1), 123-148 (1993).
- Lopez-Bendito, G., Molnar, Z. Thalamocortical development: how are we going to get there. Nat. Rev. Neurosci. 4 (4), 276-289 (2003).
- Espinosa, J. S., Stryker, M. P. Development and plasticity of the primary visual cortex. Neuron. 75 (2), 230-249 (2012).
- Portera-Cailliau, C., Weimer, R. M., De Paola, V., Caroni, P., Svoboda, K. Diverse modes of axon elaboration in the developing neocortex. PLoS Biol. 3 (8), 272 (2005).
- Holtmaat, A., Svoboda, K. Experience-dependent structural synaptic plasticity in the mammalian brain. Nat. Rev. Neurosci. 10 (9), 647-658 (2009).
- Bhatt, D. H., Zhang, S., Gan, W. B. Dendritic spine dynamics. Annu Rev Physiol. 71, 261-282 (2009).
- Yamamoto, N., Kurotani, T., Toyama, K. Neural connections between the lateral geniculate nucleus and visual cortex in vitro. Science. 245 (4914), 192-194 (1989).
- Yamamoto, N., Yamada, K., Kurotani, T., Toyama, K. Laminar specificity of extrinsic cortical connections studied in coculture preparations. Neuron. 9 (2), 217-228 (1992).
- Uesaka, N., Hirai, S., Maruyama, T., Ruthazer, E. S., Yamamoto, N. Activity dependence of cortical axon branch formation: a morphological and electrophysiological study using organotypic slice cultures. J. Neurosci. 25 (1), 1-9 (2005).
- Uesaka, N., Hayano, Y., Yamada, A., Yamamoto, N. Interplay between laminar specificity and activity-dependent mechanisms of thalamocortical axon branching. J. Neurosci. 27 (19), 5215-5223 (2007).
- Uesaka, N., Nishiwaki, M., Yamamoto, N. Single cell electroporation method for axon tracing in cultured slices. Dev. Growth Differ. 50 (6), 475-477 (2008).
- Matsumoto, N., Hoshiko, M., Sugo, N., Fukazawa, Y., Yamamoto, N. Synapse-dependent and independent mechanisms of thalamocortical axon branching are regulated by neuronal activity. Dev Neurobiol. 76 (3), 323-336 (2016).
- Matsumoto, N., Sasaki, K., Yamamoto, N. Electroporation Method for Mammalian CNS Neurons in Organotypic Slice Cultures. Electroporation Methods in Neuroscience. , 159-168 (2015).
- Molnar, Z., Blakemore, C. Lack of regional specificity for connections formed between thalamus and cortex in coculture. Nature. 351 (6326), 475-477 (1991).
- Bolz, J., Novak, N., Staiger, V. Formation of specific afferent connections in organotypic slice cultures from rat visual cortex cocultured with lateral geniculate nucleus. J. Neurosci. 12 (8), 3054-3070 (1992).
- Yamamoto, N., et al. Inhibitory mechanism by polysialic acid for lamina-specific branch formation of thalamocortical axons. J. Neurosci. 20 (24), 9145-9151 (2000).
- Yamamoto, N., et al. Characterization of factors regulating lamina-specific growth of thalamocortical axons. J Neurobiol. 42 (1), 56-68 (2000).
- Ohnami, S., et al. Role of RhoA in activity-dependent cortical axon branching. J. Neurosci. 28 (37), 9117-9121 (2008).
- Yamada, A., et al. Role of pre- and postsynaptic activity in thalamocortical axon branching. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (16), 7562-7567 (2010).
