Visualisering av Thalamocortical Axon förgrening och synapsen bildande i Organotypic Cocultures
Summary
Det här protokollet beskriver en metod för samtidig avbildning av thalamocortical axon förgrening och synapsen bildande i organotypic cocultures av thalamus och hjärnbarken. Enskilda thalamocortical axoner och deras presynaptiska terminaler visualiseras av en enda cell elektroporation teknik med DsRed och GFP-märkta synaptophysin.
Abstract
Axon förgrening och synapsen bildandet är avgörande processer för att fastställa exakt neuronala kretsar. Under utveckling bildar sensorisk thalamocortical (TC) axoner grenar och synapser i specifika lager av hjärnbarken. Trots uppenbara rumsliga sambandet mellan axon förgrening och synapsen bildandet, är orsakssambandet mellan dem dåligt förstått. För att lösa problemet, utvecklat vi nyligen en metod för samtidig avbildning av förgrening och synapsen bildandet av enskilda TC axoner i organotypic cocultures.
Det här protokollet beskriver en metod som består av en kombination av en organotypic coculture och elektroporation. Organotypic cocultures av thalamus och hjärnbarken underlätta gen manipulation och observation av axonal processer, bevara karakteristiska strukturer såsom laminar konfiguration. Två distinkta plasmider kodning DsRed och andra-taggade synaptophysin (SYP-andra) var samtidig transfekterade till ett litet antal thalamic nervceller av en elektroporation teknik. Denna metod tillät oss att visualisera enskilda axonal morfologier TC nervceller och deras presynaptiska webbplatser samtidigt. Metoden också aktiverat långsiktig observation som avslöjade orsakssambandet mellan axon förgrening och synaps bildas.
Introduction
Thalamocortical (TC) projektionen i däggdjur hjärnan är ett lämpligt system att undersöka axon vägledning och inriktning mekanismer. Under utveckling växer sensoriska TC axoner i kortikala plattan, och formuläret grenar och synapser prioriterat i lager IV av de primära sensoriska områdena i hjärnbarken1,2. Även efter etableringen av grundläggande anslutningar, är axonal arbors och synaptiska terminaler ombyggda beroende på miljöförändringar3,4. Dock är hur TC axon morfologi ändras dynamiskt dåligt känd. En av de främsta orsakerna är bristen på en lämplig teknik att iaktta strukturella förändringar på en enda cell-nivå. Även om den senaste utvecklingen inom mikroskopi, såsom 2-foton mikroskopi, har gett direkt observation av levande kortikala nervceller i vivo, finns det fortfarande tekniska begränsningar för att fånga den totala TC banor5, 6. därför in vitro- metoder för levande avbildning av TC axoner skulle ge kraftfulla verktyg för strukturella analyser av axon förgrening och synaps bildas.
Vår grupp för första gången etablerade en statisk slice kultur metod med högpermeabla membran7. Med den här metoden en råtta kortikala skiva var cocultured med en sensorisk thalamic block och lamina-specifika TC anslutningar var återgetts i detta organotypic cocultures7,8. Glesa märkning med en fluorescerande protein ytterligare tillät oss att iaktta TC axon tillväxt och gren bildandet9,10,11. Nyligen har vi utvecklat en ny metod för samtidig avbildning av förgrening och synapsen bildandet av enskilda TC axoner i organotypic cocultures12. För att visualisera TC axoner och presynaptiska platser samtidigt, var DsRed och andra-taggade synaptophysin (SYP-andra) samtidig transfekterade till ett litet antal thalamic nervceller av elektroporation av den organotypic coculture. Den nuvarande metoden underlättar Morfologisk analys av TC axoner och möjliggör långsiktig observation, som kan användas för att Visa sambandet mellan axon förgrening och synaps bildas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det nuvarande protokollet är också ett kraftfullt verktyg att studera utvecklingsmässiga aspekter av växande axoner annat än av TC projektion11. Exempelvis kan en kombination av kortikala slice kultur och elektroporation tekniken visualisera enskilda axonal morfologi av kortikala nervceller och långsiktig observation9,18.
Med hjälp av det nuvarande protokollet, kan rollerna av intressanta gener i axon fö…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar också Gabriel Hand för kritisk läsning.
Materials
| DMEM/F12 | GIBCO | 11320-033 | |
| Hanks’ balanced salt solution (HBSS) | Nissui | 5905 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Scientific | SH30396-03 | Hyclone |
| Insulin | Sigma | I6634 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888 | |
| Sodium selenite | Wako Pure Chemical Industries |
192-10843 | |
| Transferrin | Sigma | T1147 | |
| Putrescine | Sigma | P5780 | |
| Glucose | Wako Pure Chemical Industries |
16806-25 | |
| 35 mm petri dishes | Falcon | 351008 | |
| Millicell-CM insert | Millipore | PICMORG50 | |
| 100 mm petri dishes | BIO-BIK | I-90-20 | petri dish sterrile |
| HiPure Plasmid Maxiprep Kit | Invitrogen | K210006 | |
| Disposable sterile plastic pipettes | 202-IS | transfer pipets sterile | |
| Glass capillary: OD 1.2 mm | Narishige | G-1.2 | inner diameter, 1.2 mm |
| Silver wire: 0.2 and 1 mm | Nilaco | AG-401265 (diameter, 0.2 mm), AG-401485 (diameter, 1.0 mm) | |
| 1 mL syringe | Terumo | SS-01T | |
| Stimulator | A.M.P.I | Master 8 | |
| Biphasic isolator | BAK ELECTRONICS | BSI-2 | |
| Amplifier | A-M Systems | Model 1800 | |
| Oscilloscope | Hitachi | VC-6723 | |
| Manipulator | Narishige | SM-15 | |
| Micromanipulator | Narishige | MO-10 | |
| Stereomicroscope | Olympus | SZ40 | |
| Universal stand | Olympus | SZ-STU2 | |
| Light illumination system | Olympus | LG-PS2, LG-DI, HLL301 | |
| Electrode puller | Narishige | PC-10 | |
| Confocal microscope | Nikon | Digital eclipse C1 laser | |
| x20 objective | Nikon | ELWD 20x/0.45 | |
| Culture chamber | Tokai Hit | UK A16-U | |
| Sprague-Dawley (SD) rat | Japan SLC and Nihon-Dobutsu | ||
| Microsurgery scissors | Natsume | MB-54-1 |
References
- Kageyama, G. H., Robertson, R. T. Development of geniculocortical projections to visual cortex in rat: evidence early ingrowth and synaptogenesis. J. Comp. Neurol. 335 (1), 123-148 (1993).
- Lopez-Bendito, G., Molnar, Z. Thalamocortical development: how are we going to get there. Nat. Rev. Neurosci. 4 (4), 276-289 (2003).
- Espinosa, J. S., Stryker, M. P. Development and plasticity of the primary visual cortex. Neuron. 75 (2), 230-249 (2012).
- Portera-Cailliau, C., Weimer, R. M., De Paola, V., Caroni, P., Svoboda, K. Diverse modes of axon elaboration in the developing neocortex. PLoS Biol. 3 (8), 272 (2005).
- Holtmaat, A., Svoboda, K. Experience-dependent structural synaptic plasticity in the mammalian brain. Nat. Rev. Neurosci. 10 (9), 647-658 (2009).
- Bhatt, D. H., Zhang, S., Gan, W. B. Dendritic spine dynamics. Annu Rev Physiol. 71, 261-282 (2009).
- Yamamoto, N., Kurotani, T., Toyama, K. Neural connections between the lateral geniculate nucleus and visual cortex in vitro. Science. 245 (4914), 192-194 (1989).
- Yamamoto, N., Yamada, K., Kurotani, T., Toyama, K. Laminar specificity of extrinsic cortical connections studied in coculture preparations. Neuron. 9 (2), 217-228 (1992).
- Uesaka, N., Hirai, S., Maruyama, T., Ruthazer, E. S., Yamamoto, N. Activity dependence of cortical axon branch formation: a morphological and electrophysiological study using organotypic slice cultures. J. Neurosci. 25 (1), 1-9 (2005).
- Uesaka, N., Hayano, Y., Yamada, A., Yamamoto, N. Interplay between laminar specificity and activity-dependent mechanisms of thalamocortical axon branching. J. Neurosci. 27 (19), 5215-5223 (2007).
- Uesaka, N., Nishiwaki, M., Yamamoto, N. Single cell electroporation method for axon tracing in cultured slices. Dev. Growth Differ. 50 (6), 475-477 (2008).
- Matsumoto, N., Hoshiko, M., Sugo, N., Fukazawa, Y., Yamamoto, N. Synapse-dependent and independent mechanisms of thalamocortical axon branching are regulated by neuronal activity. Dev Neurobiol. 76 (3), 323-336 (2016).
- Matsumoto, N., Sasaki, K., Yamamoto, N. Electroporation Method for Mammalian CNS Neurons in Organotypic Slice Cultures. Electroporation Methods in Neuroscience. , 159-168 (2015).
- Molnar, Z., Blakemore, C. Lack of regional specificity for connections formed between thalamus and cortex in coculture. Nature. 351 (6326), 475-477 (1991).
- Bolz, J., Novak, N., Staiger, V. Formation of specific afferent connections in organotypic slice cultures from rat visual cortex cocultured with lateral geniculate nucleus. J. Neurosci. 12 (8), 3054-3070 (1992).
- Yamamoto, N., et al. Inhibitory mechanism by polysialic acid for lamina-specific branch formation of thalamocortical axons. J. Neurosci. 20 (24), 9145-9151 (2000).
- Yamamoto, N., et al. Characterization of factors regulating lamina-specific growth of thalamocortical axons. J Neurobiol. 42 (1), 56-68 (2000).
- Ohnami, S., et al. Role of RhoA in activity-dependent cortical axon branching. J. Neurosci. 28 (37), 9117-9121 (2008).
- Yamada, A., et al. Role of pre- and postsynaptic activity in thalamocortical axon branching. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (16), 7562-7567 (2010).
