Caractérisation des Extensions de la Membrane cellulaire et d’étudier leur rôle dans le Cancer Cell Adhesion dynamique

Summary

Cette étude démontre l’utilité et la facilité de la mesure d’extension quantitative de membrane cellulaire et sa corrélation avec la capacité adhésive des cellules. Comme un exemple représentatif, nous montrons ici que Dickkopf-protéine 3 (DKK3) favorise la formation de lobopodia accrue et l’adhérence cellulaire dans le corticosurrénalome cellules in vitro.

Abstract

Répertoire d’extension de la membrane de la cellule module divers comportements malignes des cellules cancéreuses, y compris leurs potentiels d’adhésif et migrateurs. La capacité avec précision, classer et quantifier des extensions de la cellule et mesurer l’effet sur la capacité adhésive de la cellule est jugés essentielle pour déterminer comment signalisation cellulaire événements incidence du cancer cell comportement et agressivité. Nous décrivons ici la in vitro la conception et l’utilisation d’une cellule extension quantification méthode conjointement avec un test de capacité d’adhérence un modèle établi in vitro de corticosurrénalome (ACC). Plus précisément, nous testons les effets de DKK3, un suppresseur de tumeur présumée et un facteur de différenciation favorable, sur le phénotype d’extension de membrane d’une lignée cellulaire ACC, SW-13. Nous proposons ces dosages à fournir relativement simple, fiable et facilement interprétable métriques à mesure ces caractéristiques dans des conditions expérimentales différentes.

Introduction

Dysregulated WNT signaling joue un rôle essentiel dans la corticosurrénale malignités¹. Les méthodes utilisées dans cette étude étudient si silencieux de DKK3, un régulateur négatif de signalisation WNT, représente un événement de dédifférenciation dans le cortex surrénal et favorise la formation de tumeurs dans le contexte des changements de répertoire de cellule-extension. DKK3 est un 38 kDa sécrétée glycoprotéine avec un peptide signal de N-terminal et études antérieures ont démontré que son expression forcée a abouti à l’arrêt du cycle cellulaire, inhibe le comportement agressif de malin et inversé épithéliale-mésenchymateuse transition

Protocol

1. caractéristiques de l’Extension des cellules

1. Maintenir SW-13, SW-Neo et SW-DKK3 des cellules dans un incubateur humidifié standard à 37,0 ° C et 5 % de CO₂ dans un milieu d’Eagle modifié de Dulbecco additionné de sérum de veau fœtal 10 % et de 10 000 U/mL de pénicilline et de streptomycine (désignée comme « moyenne de croissance »).
   1. Compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre et plaque 5 000 cellules / puits pour SW-13, SW-Neo et SW-DKK3 lignes en plaques 6 puits distinctes et se développent pendant la nuit dans le milieu sur couvre-objet en verre stérile.
2. Après la croissance durant la nuit, pour chaque puits....

Results

En utilisant les tests ci-dessus, les effets de la surexpression de la DKK3 sur la morphologie cellulaire extension et propriétés d’adhérence cellulaire ont été testés dans la lignée du CAC établie SW-13, in vitro. Les cellules surexprimant DKK3 ont été générés par stablement transfectants SW-13 cellules avec Myc-DDK étiqueté pCMV6-entrée/DKK3 plasmide vecteur et désigné comme SW-DKK3. De même, cellules stablement transfectées avec le vecteur vide pCMV6-entrée ont été créés comme.......

Discussion

Nous décrivons ici une méthode quantitative in vitro afin de caractériser les extensions de la cellule avec facilité, quelques pièges et reproductibilité fiable qui peut être appliquée pour différentes conditions de test. En outre, essais d’adhésion et/ou la motilité simples, quantifiables peuvent être effectuées simultanément pour mettre en corrélation pouvant avoir une importance fonctionnelle des altérations observées dans les extensions de la membrane cellulaire.

Cependant, ces mé.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	ThermoFisher	11965-092	Complété par du sérum de veau fœtal et de la péniclline et de la streptomycine
Solution saline tamponnée au phosphate Deulbeco’s	Sigma-Aldrich	D8537 1X	, utilisée directement
3,7 % de formaldéhyde.	Sigma-Aldrich	F8775	Solution mère diluée
à 0,05 % de violet cristallin	Harleco	192-12	Solution mère diluée
eau désionisée	NA	NA	NA NA
avec grossissement 400X  ;	NA	NA	NA
Plaques à 6 puits	Corning	353046	NA
Solution de dissociation cellulaire non enzymatique 1X	Sigma-Aldrich	C5914  ;	Solution 1X, utilisée directement