Karakteristikk av cellemembranen utvidelser og studere deres roller i kreft celle vedheft Dynamics
Summary
Denne studien viser av og kvantitative cellemembranen forlengelsen måling og dets sammenheng med selvklebende kapasitet celler. Som et representativt eksempel viser vi her at Dickkopf-relaterte proteiner 3 (DKK3) fremmer økt lobopodia formasjon og celle feste i adrenocortical karsinom celler i vitro.
Abstract
Cellemembranens forlengelse repertoar modulerer ulike ondartet atferd av kreftceller, inkludert deres klebende og vandrende potensialer. Nøyaktig klassifisere og kvantifisere celle utvidelser og måle effekten på en celle selvklebende kapasitet er avgjørende for å bestemme hvordan celle signalisering hendelser innvirkningsvirkemåte kreft cellen og aggressivitet. Her beskriver vi i vitro design og bruk av en celle forlengelsen kvantifisering metode i forbindelse med vedheft kapasitet analysen en etablert i vitro modell for adrenocortical karsinom (ACC). Spesielt teste vi effekten av DKK3, en antatte tumor suppressor og en Pro differensiering faktor, på membran forlengelsen fenotypen av ACC celle linjen, SW-13. Vi foreslår disse analyser å gi relativt enkel, pålitelig og lett interpretable beregninger for måler disse egenskapene under ulike eksperimentelle forhold.
Introduction
Dysregulated WNT signalering spiller en avgjørende rolle i adrenocortical malignitet1. Metodene som brukes i denne studien undersøker om stanse DKK3, en negativ regulator WNT signalnettverk, representerer en dedifferentiation hendelse i binyrebarken og fremmer tumor dannelse i sammenheng av celle-utvidelse repertoar endringer. DKK3 er en 38 kDa utskilles glykoprotein med en N-terminal signal peptid og tidligere studier har vist at håndheves uttrykket resulterte i celle syklus arrestasjon, hemmet aggressiv malign atferd og reversert epithelial-mesenchymal overgang2.
Ondartet atferden til adrenocortical karsinom (ACC) og andre kreftformer er, delvis, påvirket av evnen av kreftceller grensesnitt med omkringliggende overflater, inkludert ekstracellulær matrix, som igjen muliggjør svulst celle invasjonen og migrasjon3. Rollen av bestemte cellemembranen filtyper i kreft progresjon blir stadig demonstrert i ulike sammenhenger, hovedsakelig via dannelsen av filopodia. For eksempel har overuttrykte L-type kalsium kanaler blitt funnet å skape filopodia og fremme svulst celle invasjonen4. Tilsvarende Fascin, en utgangen bindende protein minimal uttrykt i normalt vev, er også overexpressed i kreftceller i tilknytning til filopodia dannelse5. Lobopodia formasjon gjør ikke-ondartet fibroblaster overføre effektivt gjennom ekstra-mobile matrix, men det har vist at fibrosarcoma celler er avhengige av metalloproteinase aktivitet i stedet for lobopodia å lette celle migrasjon og invasjonen6. Vi har vist at svulsten suppressors, inkludert Ras association domene familie 1 isoformen en (RASSF1A) og DKK3, kan funksjonen å endre cellen cytoskjelett elementer og fremme lamellipodia formasjon og stymie invasiv egenskaper7,8.
Som sådan, er det avgjørende å karakterisere effekten av gener involvert i kreft og deres forhold til cellemembranen utvidelse endringer, spesielt vurdere filopodia, lobopodia og lamellipodia formasjon under testforhold. Gjeldende state-of-the art teknikker inkluderer bruk av stadig mer sofistikerte mikroskopi metoder, fluorescerende merking eller komplekse datamaskinalgoritmer for datainnsamling og tolkning. Disse metodene gir nye analytiske verktøy, begrenser kompleksitet deres utbredt bruk og tilpasningsevne i cellen biologiske forsøk. Videre er presis kvantifisering og observasjon av endringer i celle forlengelsen morfologi ikke vanligvis målt9,10. I kontrast, introduserer vi en teknikk her som nøyaktig kvantifiserer celle forlengelsen endringer ved hjelp av standard mikroskopiske teknikker og lett tilpasses i vitro metoder. Disse metodene også kvantifisere hver celle forlengelsen type samtidig i hver celle analysert og finne generelle endringer i cellemembranen forlengelsen repertoaret. Vi viser også hvordan disse endringene kan forholde seg til celle vedheft egenskaper.
Eksperimentell eksempel vil vi bruke en tidligere opprettet cellen linje av SW-13, utpekt SW-DDK3, som har vært stabilt transfekterte med pCMV6-oppføringen/DKK3 plasmider vektorer og constitutively overexpresses DKK3, en distinktiv faktor i binyrene. Non-transfekterte SW-13 cellene og SW-13 stabilt transfekterte med Tom vektor (pCMV6-inngang), utpekt SW-Neo, vil tjene som eksperimentelle kontroller.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her beskriver vi en i vitro kvantitativ metode betegner celle extensions med letthet, noen pit-falls og pålitelig reproduserbarhet som kan brukes for ulike testforhold. Videre kan enkelt, målbare vedheft og/eller motilitet analyser utføres samtidig for å sammenligne potensielle funksjonelle betydningen av observerte endringer i cellemembranen utvidelser.
Men kan disse metodene presentere noen potensielle begrensninger. Først kriteriene angitt her å identifisere ulike typer celle…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ohse Grant Foundation finansiert dette arbeidet.
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | ThermoFisher | 11965-092 | Supplemented with fetal bovine serum and penicllin and streptomycin |
| Deulbeco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | 1X solution, used directly |
| 3.7% formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Dilute stock solution |
| 0.05% crystal violet | Harleco | 192-12 | Dilute stock solution |
| De-ionized water | NA | NA | NA |
| Microscope with 400X magnification | NA | NA | NA |
| 6-well plates | Corning | 353046 | NA |
| Cell dissociation solution non-enzymatic 1X | Sigma-Aldrich | C5914 | 1X solution, used directly |
References
- Libe, R., Fratticci, A., Bertherat, J. Adrenocortical cancer: pathophysiology and clinical management. Endocrine-related cancer. 14 (1), 13-28 (2007).
- Veeck, J., Dahl, E. Targeting the Wnt pathway in cancer: the emerging role of Dickkopf-3. Biochimica et biophysica acta. 1825 (1), 18-28 (2012).
- Friedl, P., Gilmour, D. Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (7), 445-457 (2009).
- Jacquemet, G., et al. L-type calcium channels regulate filopodia stability and cancer cell invasion downstream of integrin signalling. Nat Commun. 7, 13297 (2016).
- Machesky, L. M., Li, A. Fascin: Invasive filopodia promoting metastasis. Commun Integr Biol. 3 (3), 263-270 (2010).
- Petrie, R. J., Harlin, H. M., Korsak, L. I., Yamada, K. M. Activating the nuclear piston mechanism of 3D migration in tumor cells. J Cell Biol. 216 (1), 93-100 (2017).
- Korah, R., et al. Epigenetic silencing of RASSF1A deregulates cytoskeleton and promotes malignant behavior of adrenocortical carcinoma. Molecular cancer. 12, 87 (2013).
- Cheng, J. Y., et al. A novel FOXO1-mediated dedifferentiation blocking role for DKK3 in adrenocortical carcinogenesis. BMC cancer. 17 (1), 164 (2017).
- Barry, D. J., Durkin, C. H., Abella, J. V., Way, M. Open source software for quantification of cell migration, protrusions, and fluorescence intensities. J Cell Biol. 209 (1), 163-180 (2015).
- Cliffe, A., et al. Quantitative 3D analysis of complex single border cell behaviors in coordinated collective cell migration. Nat Commun. 8, 14905 (2017).
