Модель Pentylenetetrazole индуцированной растопку мыши

Summary

Этот протокол описывает метод химического растопки с pentylenetetrazole и предоставляет мышиной модели эпилепсии. Этот протокол также может использоваться расследовать уязвимость захват индукционные и патогенеза после эпилептические припадки у мышей.

Abstract

Pentylenetetrazole (PTZ) является антагонистом ГАМК-А рецепторов. Внутрибрюшинной инъекции PTZ в животное индуцирует острый, тяжелой захват в высокой дозе, в то время как последовательные инъекции subconvulsive дозы были использованы для разработки химического, блоки розжига, модели эпилепсии. Однократное введение малых доз PTZ индуцирует мягкий захват без судорог. Однако повторяющихся низкой дозы инъекций PTZ снизить порог вызывают судорожного приступа. Наконец непрерывной низкодозированные управление PTZ индуцирует тяжелой тонизирующий клонические захват. Этот метод является простым и широко применяются для изучения патофизиологии эпилепсии, который определяется как хроническая болезнь, которая включает повторяющиеся приступы. Это химическое вещество, разжигания протокол вызывает повторяющиеся судороги в животных. С помощью этого метода оценкам уязвимости PTZ-опосредованной изъятий или степень обострение эпилептические припадки. Эти преимущества привели к использованию данного метода для проверки Средства противоэпилептические и генов, связанных с эпилепсией. Кроме того этот метод был использован расследовать нейрональных повреждения после эпилептических припадков, потому что гистологические изменения, наблюдаемые в мозг больных эпилепсией, также появляются в мозг химических возгорелся животных. Таким образом этот протокол является полезным для удобно производить Животные модели эпилепсии.

Introduction

Эпилепсия является хронические неврологические расстройства, которое характеризуется периодические приступы и затрагивает приблизительно 1% людей. Основных механизмов формирования epileptogenesis и изъятие у больных эпилепсией не выяснен в клинических исследованиях. Таким образом является подходящей моделью животных требуется для изучения эпилепсии¹.

Разнообразие животных моделей эпилепсии были использованы для изучения физиологии эпилепсии и выявления анти-эпилептических наркотиков^2,3. Среди этих моделей фармакологические захват индукции это общий метод, используемый для создания модели на животных для расследования случаев патологии эпилепсии⁴. Этот метод является недорогим и простым. Электрод опосредованной растопку также часто используемый метод, но расходы на этой процедуры, выше, и метод требует хирургического и электрические навыки, чтобы побудить повторяющиеся приступы⁵.

Фармакологических индукции также выгодно, потому что легко контролируются сроки и количество изъятий. Генетическая мыши модели, которые exhibit спонтанные судороги используются также в изучении эпилепсии. Однако предсказать, когда и как часто судороги возникают в этих генетических модели может быть невозможным⁶. Система мониторинга требуется соблюдать эпилептические поведение генетически измененных мышей⁶.

Каиновая кислота, пилокарпин и pentylenetetrazole (PTZ) широко используются как захват заставить наркотиков⁷. Каиновая кислота является агонистом рецепторов глутамата, а пилокарпин активирует холинергических рецепторов. PTZ-это гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК)-антагонист рецепторов⁸. PTZ подавляет функцию тормозящее синапсы, приводит к увеличению активности нейронов. Это положение вызывает обобщенных изъятий в животных⁹. Одной инъекции Каиновая кислоты и пилокарпин может вызвать острые приступы, особенно статус эпилептический (SE)^10,11 и Каиновая кислота – или пилокарпин опосредованной SE способствует хронической спонтанной и периодические приступы^{12 , 13}. Энцефалографические (ЭЭГ) записи и анализа поведения указали, что спонтанное периодические приступы наблюдаются через месяц после однократной инъекции^12,13. Одной инъекции судорожными дозы PTZ также вызывает острый захват. Однако трудно содействовать хронический спонтанные судороги после однократной инъекции PTZ. Хронический управление PTZ требуется навести повторяющиеся приступы¹⁴. В любом методе поколение повторяющиеся приступы способен побудить больше похожи на что человека эпилепсии, чем поколение острые приступы патологии. В случае PTZ каждой инъекции вызывает захват, и захват тяжести становится более серьезным образом поэтапно с каждой инъекции. Наконец одной инъекции PTZ низких доз вызывает тяжелых тонизирующий клонические захват. В этой фазе каждый инъекций вызывает серьезные судороги. Кроме того Задержка захвата и продолжительность также изменить течение инъекции. Задержка захвата тоник часто становится короче на последнем этапе разжигания¹⁵. Кроме того захват обострения сопровождается длительной захват продолжительность¹⁶. Исследуя молекулярный механизм, регулирующий серьезность захват, задержка и продолжительность полезен для скрининга анти-эпилептических наркотиков^17,18,19.

Приступы часто индуцированных единого системного управления PTZ, и восстановление очень быстро, в течение 30 мин^4,5. Таким образом количество изъятий более управляема в модели PTZ-растопку. Однако ЭЭГ-мониторинг указал, что обобщенные пики могут рассматриваться до 12 ч после PTZ-опосредованной захвата²⁰. Таким образом животные предпочтительно должен оставаться под наблюдением за 24 ч после миоклоническая или тонизирующим захват²¹ для более точного анализа механизмов растопку.

Администрация анти-эпилептических наркотиков, таких как этосуксимид, вальпроат, фенобарбитал, Вигабатрин и retigabine³, до или после инъекции PTZ снижает опасность обострения захват тяжести^{3,22, 23}. Аналогичным образом было показано нокаут мышей, что отсутствие генов участвует в захват обострения, например матрицы металлопротеиназы-9²⁴, FGF-22²⁵ и neuritin²⁶, демонстрируют снижение захвата тяжести после нескольких PTZ инъекции. Кроме того наблюдая гистопатологические изменения после эпилептические припадки возможен с помощью этого метода. У больных с височной эпилепсией есть типичные гистологические изменения в головном мозге, например моховые волокна прорастают^27,28, Аномальные гранул нейрон миграции²⁹, astrogliosis³⁰, нейрональные клетки смерть в гиппокампе^31,32и³³склероз гиппокампа. Аналогичные изменения наблюдаются в эпилептические модель животных. Среди доступных методов PTZ-опосредованной химических растопку является хорошим, воспроизводимые и недорогой способ получения животной модели эпилепсии. В модели пилокарпин опосредованной SE захват управления трудно и много мышей умрет или не развивать SE³⁴. В отличие от этого смертности и тяжести захват более управляемой в модели PTZ. Кроме того PTZ является менее дорогостоящим, чем Каиновая кислоты, и для введения препарата не требуются навыки в хирургии мозга мыши.

Protocol

Все экспериментальные процедуры были утверждены животное уход и использование Комитета Токио Метрополитен института медицинских наук. Послеродовые 8 – рекомендуется 16-week-old мышей. Все инбредных деформации является приемлемым для эксперимента. Мышей C57Bl/6 более устойчивы к PTZ, тогда как ?…

Representative Results

Повторяющихся инъекций PTZ индуцирует увеличение тяжести изъятия. Шесть мышей C57BL/6 относились с PTZ, и еще 6 мышей были относиться с saline как в контрольной группе. PTZ доза была 35 мг/кг, и осуществлялось 10 инъекций. Оценка захват постепенно увеличилось с PTZ инъекции, в то время …

Discussion

Здесь мы представляем широко доступной протокол для создания фармакологических животной модели эпилепсии. PTZ-опосредованной химических растопку имеет долгую историю и является общепринятой моделью для изучения гистопатология и клеточной патологии эпилепсии⁴¹. Химическ?…

Materials

Pentylenetetrazole	Sigma-Aldrich	P6500
Sodium chloride	MANAC	7647-14-5
Mouse	CLEA Japan		C57Bl/6NJcl, postnatal 8 week, male
Syringe (1mL)	Terumo	SS-01T
Needle(27G x 3/4") (0.40 x 19 mm)	Terumo	NN-2719S
Weighing scale	Mettler	PE2000	This item is a discontinued product. Almost equivalent to FX-2000i with FXi-12-JA from A&D company.
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
Sodium hydroxide	nacalai tesque	31511-05
Peristatic pump	ATTO	SJ1211
Sucrose	nacalai tesque	30404-45
Microtome	Yamato	REM-700	This item is a discontinued product. Almost equivalent to REM-710
Microtome blade	Feather	S35
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X-100
anti-synaptoporin antibody	Synaptic systems	102 002
anti-ZnT3 antibody	Synaptic systems	197 002
anti-doublecortin	Santa Cruz	sc-8066	This item is a discontinued product. We did not test equivalent product (sc-271390).
Contextual fear discrimination test apparatus	O'hara
Three chamber test apparatus	Muromachi