Pentylenetetrazole-induzierten anzünden-Maus-Modell

Summary

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode des chemischen anzünden mit Pentylenetetrazole und bietet einem Mausmodell der Epilepsie. Dieses Protokoll kann auch zur Anfälligkeit für Beschlagnahme Induktion und Pathogenese nach epileptischen Anfällen bei Mäusen zu untersuchen.

Abstract

Pentylenetetrazole (PTZ) ist ein GABA-A-Rezeptor-Antagonist. Eine intraperitoneale Injektion von PTZ in ein Tier induziert einen akuten, schweren Anfall bei einer hohen Dosis während sequenzielle Injektionen einer subconvulsive Dosis für die Entwicklung von chemischen kindling, eine Epilepsie-Modell verwendet wurden. Eine niedrig dosierte Injektion des PTZ induziert einen leichten Anfall ohne Krampf. Jedoch verringern sich wiederholende niedrig dosierte Injektionen von PTZ die Schwelle um einen krampfartigen Anfall hervorrufen. Kontinuierliche niedrig dosierte Verabreichung von PTZ induziert schließlich einen schweren Tonikum-klonischen Anfall. Diese Methode ist einfach und vielseitig einsetzbar, die Pathophysiologie der Epilepsie, die ist definiert als eine chronische Erkrankung, die sich wiederholende Anfälle beinhaltet zu untersuchen. Diese Chemikalie Anfeuerholz Protokoll verursacht wiederkehrende Anfälle bei Tieren. Mit dieser Methode schätzte Anfälligkeit für PTZ-vermittelten Anfälle oder der Grad der Erschwerung von epileptischen Anfällen. Diese Vorteile führten zu die Verwendung dieser Methode für das screening von Antiepileptika Medikamente und Epilepsie-Genen. Darüber hinaus wurde diese Methode zur neuronalen Schaden nach epileptischen Anfällen zu untersuchen, weil die histologischen Veränderungen in den Gehirnen von epileptischen Patienten auch in den Gehirnen der Chemikalie angezündet Tiere erscheinen. Somit eignet sich dieses Protokoll für die Herstellung von bequem Tiermodellen der Epilepsie.

Introduction

Epilepsie ist eine chronische neurologische Erkrankung, die zeichnet sich durch wiederkehrende Anfälle und betrifft etwa 1 % der Menschen. Die zugrunde liegenden Mechanismen der Epileptogenesis und Beschlagnahme Generation bei Epilepsiepatienten können nicht vollständig in den klinischen Studien geklärt werden. Daher ist einem geeigneten Tiermodell zur Erforschung der Epilepsie¹erforderlich.

Eine Vielzahl von Tiermodellen der Epilepsie haben verwendet worden, zu untersuchen, die Physiologie der Epilepsie und Antiepileptika Medikamente^2,3zu identifizieren. Unter diesen Modellen ist die pharmakologische Beschlagnahme Induktion eine gängige Methode zur Erzeugung von einem Tiermodell zur Untersuchung von der Pathologie des Epilepsie-⁴. Diese Methode ist kostengünstig und einfach. Elektrode-vermittelten anzünden ist auch eine häufig verwendete Methode, aber die Kosten dieses Verfahrens sind höher, und die Methode erfordert chirurgische und elektrische Fähigkeiten, sich wiederholende Anfälle⁵zu induzieren.

Pharmakologische Induktion ist auch vorteilhaft, da das Timing und die Zahl der Sicherstellungen von leicht gesteuert werden. Genetischer Mausmodelle, die spontanen Anfälle aufweisen sind auch in der Studie von Epilepsie verwendet. Vorhersagen, wann und wie oft die Anfälle in diesen genetischen Modellen auftreten kann jedoch unmöglich⁶sein. Ein monitoring-System ist erforderlich, um das epileptische Verhalten von genetisch veränderten Mäusen⁶zu beobachten.

Kainic Säure, Pilocarpin und Pentylenetetrazole (PTZ) sind als Beschlagnahme-induzierende Medikamente⁷verbreitet. Kainic Säure ist ein Agonist für Glutamat-Rezeptoren und Pilocarpin cholinerge Rezeptoren aktiviert. PTZ ist ein Gamma-Aminobuttersäure (GABA)-ein Rezeptor-Antagonist-⁸. PTZ unterdrückt die hemmenden Synapsen-Funktion führt zu erhöhter neuronaler Aktivität. Dieser Verordnung verursacht Generalisierte Anfälle in Tiere⁹. Eine einmalige Injektion von Kainic Säure und Pilocarpin induzieren kann akute Anfälle, vor allem Status Epilepticus (SE)^10,11 und Kainic Säure – oder Pilocarpin-vermittelten SE fördert chronische spontane und wiederkehrende Anfälle^{12 , 13}. EEG (EEG) Aufnahmen und Verhaltensanalyse haben gezeigt, dass spontane wiederkehrende Anfälle pro Monat nach einer einzigen Injektion^12,13eingehalten werden. Eine einmalige Injektion einer konvulsiven Dosis von PTZ induziert auch akuten Anfall. Chronische spontane Anfälle nach einer einzelnen Injektion des PTZ sind jedoch schwer zu fördern. Chronische Verabreichung von PTZ ist erforderlich, um sich wiederholende Anfälle¹⁴zu induzieren. Bei beiden Methoden ist die Generation der sich wiederholende Anfälle in der Lage, eine Pathologie der menschlichen Epilepsie ähnlicher als die Generation der akute Anfälle auslösen. Bei PTZ jeder Injektion erinnert an einen Anfall, und Beschlagnahme Schweregrad wird in gewissem Sinne schrittweise bei jeder Injektion schwerer. Zu guter Letzt induziert eine niedrig dosierte PTZ Injektion einen schweren Tonikum-klonischen Anfall. In dieser Phase ruft jeder Injektion schwere Anfälle. Darüber hinaus ändern die Beschlagnahme Latenz und Dauer auch im Laufe der Injektionen. Die Latenz zu tonischen Anfall wird oft in der Spätphase der kindling¹⁵verkürzt. Darüber hinaus ist eine verlängerte Beschlagnahme Dauer¹⁶Beschlagnahme Verschlimmerung begleitet. Untersuchen die molekulare Mechanismen zur Regulierung der Beschlagnahme schwere, ist Latenz und Dauer nützlich für das screening von Antiepileptika Medikamente^17,18,19.

Anfälle sind häufig durch eine einzelne systemische Verabreichung von PTZ induziert, und die Erholung ist sehr schnell, innerhalb von 30 min^4,5. So ist die Zahl der Sicherstellungen im PTZ-anzünden-Modell besser kontrollierbar. Allerdings hat das EEG Überwachung angedeutet, dass generalisierte Spikes bis zu 12 h nach PTZ-vermittelten Beschlagnahme²⁰gesehen werden können. Tiere sollten daher vorzugsweise unter Beobachtung für 24 h nach der Tonika oder myoklonische Anfall²¹ für eine genauere Analyse der Mechanismen, Kleinholz bleiben.

Die Verabreichung von Medikamenten Antiepileptika, z. B. Ethosuximide, Valproat, Phenobarbital, Vigabatrin und retigabin³, vor oder nach der Injektion PTZ mildert die Verschlimmerung der Beschlagnahme Schweregrad^{3,22, 23}. Ebenso zeigten Knockout-Mäusen, dass Beschlagnahme Exazerbation, wie Matrix-Metalloproteinase-9-²⁴, FGF-22²⁵ und Neuritin²⁶, fehlende Gene beteiligt zu reduzierten Beschlagnahme Schweregrad nach PTZ Mehrfacheinspritzungen aufweisen. Darüber hinaus beobachten histopathologische Veränderungen nach epileptische Anfällen ist mit dieser Methode möglich. Bei Patienten mit Temporallappen-Epilepsie gibt es typische histologische Veränderungen im Gehirn, wie moosige Faser sprießen,^27,28, abnorme Granulat Neuron Migration²⁹, Astrogliosis³⁰, neuronale Zelle Tod im Hippocampus^31,32und hippocampale Sklerose³³. Ähnliche Veränderungen sind bei epileptischen Modell Tieren beobachtet. Unter den verfügbaren Methoden ist PTZ-vermittelten chemischen anzünden eine gute, reproduzierbare und kostengünstige Methode, einem Tiermodell der Epilepsie zu produzieren. In einem Pilocarpin-vermittelten SE Modell Anfallskontrolle ist schwierig und viele Mäuse sterben oder nicht SE³⁴weiterentwickeln. Im Gegensatz dazu sind Sterblichkeit und schwere Anfall besser kontrollierbar im PTZ Modell. Darüber hinaus PTZ ist weniger teuer als Kainic Säure und Maus Gehirnchirurgie sind nicht für die Medikamentengabe erforderlich.

Protocol

Animal Care und Use Committee des Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science stimmten alle experimentelle Verfahren. Postnatale 8 – 16 Wochen alten Mäusen empfohlen. Jede Inzucht Belastung ist akzeptabel für das Experiment. C57BL/6 Mäusen sind widerstandsfähiger gegen PTZ, während BALB/c und Swiss Albino-Mäuse für PTZ empfindlicher sind. C57BL/6 wurden in dieser Studie verwendet. Anfälligkeit für PTZ hängt auch vom Alter der Maus. Im Vergleich zu jüngeren Mäusen, sind ältere Mäuse mehr refraktär gegen…

Representative Results

Wiederholte Injektion von PTZ induziert eine Steigerung im Anfall Schweregrad. Sechs C57BL/6 Mäusen mit PTZ behandelt wurden, und ein weiteres 6 Mäuse mit Kochsalzlösung als Kontrollgruppe behandelt wurden. Die PTZ-Dosis betrug 35 mg/kg und 10 Injektionen verabreicht wurden. Die Beschlagnahme Punktzahl stieg allmählich mit PTZ-Injektionen, während keine Anfälle oder abnormen Verhaltensweisen durch Kochsalzlösung Injektionen (Abbildung 2) hervorgerufen …

Discussion

Hier präsentieren wir Ihnen eine allgemein zugängliche Protokoll für die Errichtung einer pharmakologischen Tiermodell der Epilepsie. PTZ-vermittelten chemischen anzünden hat eine lange Geschichte und ist ein allgemein anerkanntes Modell für die Untersuchung der Histopathologie und Cellular Pathologie von Epilepsie⁴¹. Das chemische anzünden-Modell der Epilepsie wurde zuvor von Suzdak und Jansen, 1995⁴²geprüft. Pharmakologische Beschlagnahme Induktion, vor allem mit P…

Materials

Pentylenetetrazole	Sigma-Aldrich	P6500
Sodium chloride	MANAC	7647-14-5
Mouse	CLEA Japan		C57Bl/6NJcl, postnatal 8 week, male
Syringe (1mL)	Terumo	SS-01T
Needle(27G x 3/4") (0.40 x 19 mm)	Terumo	NN-2719S
Weighing scale	Mettler	PE2000	This item is a discontinued product. Almost equivalent to FX-2000i with FXi-12-JA from A&D company.
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
Sodium hydroxide	nacalai tesque	31511-05
Peristatic pump	ATTO	SJ1211
Sucrose	nacalai tesque	30404-45
Microtome	Yamato	REM-700	This item is a discontinued product. Almost equivalent to REM-710
Microtome blade	Feather	S35
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X-100
anti-synaptoporin antibody	Synaptic systems	102 002
anti-ZnT3 antibody	Synaptic systems	197 002
anti-doublecortin	Santa Cruz	sc-8066	This item is a discontinued product. We did not test equivalent product (sc-271390).
Contextual fear discrimination test apparatus	O'hara
Three chamber test apparatus	Muromachi