الفيديو خالية من عدسة مجهرية للدينامية والتحليل الكمي للثقافة الخلية ملتصقة
Summary
مجهرية خالية من عدسة الفيديو تمكننا من رصد الثقافات الخلية مباشرة داخل الحاضنة. هنا يمكننا وصف كامل البروتوكول المستخدمة لاكتساب وتحليل عملية شراء 2.7 يوم طويل من خلايا هيلا مثقف، مما يؤدي إلى dataset من 2.2 x 106 قياسات مورفولوجيا الخلايا الفردية ودورة الخلية 10584 المسارات.
Abstract
هنا، علينا أن نبرهن أن الفيديو خالية من عدسة مجهرية تمكننا من التقاط حركية الآلاف من الخلايا مباشرة داخل الحاضنة في وقت واحد، وأنه من الممكن لرصد وتحديد خلايا مفردة على طول عدة دورات الخلية. يصف لنا كامل البروتوكول المستخدمة لرصد وقياس ثقافة خلية هيلا لأيام 2.7. أولاً، يتم تنفيذ اكتساب ثقافة الخلية مجهر خالية من عدسة فيديو، وثم يتم تحليل البيانات بعد عملية من أربع خطوات: التعمير المجسم متعدد الطول الموجي، تتبع الخلية، الخلية تجزئة وانقسام الخلية الكشف خوارزميات. نتيجة لذلك نحن تظهر أنه من الممكن جمع من dataset يضم أكثر من المسارات دورة الخلية 10,000 وأكثر من 2 × 106 خلية القياسات المورفولوجية.
Introduction
رصد خلايا الثدييات مثقف طوال عدة دورات الخلية وقياس دقة الخلية خلية وحجم الكتلة الجافة مهمة صعبة. العديد من التقنيات البصرية خالية من التسمية قادرة على أداء هذه المهمة1،2: التحول من مرحلة قياس التداخل3، الميكروسكوب المجسم الرقمي (DHM)4،،من56، 7، كوادريوافي الجانبي القص التداخلي8،9 والكمية المرحلة التصوير المقطعي10،11. وأدت هذه الأساليب إلى العديد من الأفكار الجديدة في فهم دورة خلية من خلايا الثدييات. لكن نادراً ما كانت تقترن بالتلقائية خلية تتبع خوارزميات والإنتاجية بهم لا يزال محدودا عند قياس الخلية مسارات الشامل1 (N < 20 على التوالي3،،من45 , 6). وبالتالي مطلوب طريقة بصرية جديدة لقياس مسارات الخلية الجماعية مع إحصاءات كبيرة (N > 1000).
في هذه الورقة، ونظهر قدرة مجهرية خالية من عدسة الفيديو الصورة في الوقت نفسه آلاف خلايا مباشرة داخل الحاضنة، وثم تحديد المقاييس خلية واحدة على طول آلاف مسارات الفردية دورة الخلية. خالية من عدسة مجهرية هو مرحلة كمية التصوير الأسلوب الذي يتيح الحصول على صورة المرحلة من كثافة الخلايا عبر مجال رؤية كبير جداً (عادة عدة عشرات من مم2، هنا 29.4 مم2)12،13 ،،من1415. يتم تحديد المقاييس عدة على مستوى الخلية الواحدة، مثلاً، خلية المنطقة وخلية الكتلة الجافة، وسمك الخلية، طول المحور الرئيسية الخلية والخلية نسبة العرض إلى الارتفاع12،15عاماً من كل صورة. ثم قم بتطبيق خوارزمية تتبع الخلية، يمكن رسم هذه الميزات لكل خلية واحدة كدالة لل14،وقت التجربة15. وعلاوة على ذلك، عن طريق الكشف عن حدوث انقسامات الخلية في مسارات الخلية، فمن الممكن لاستخراج معلومات هامة أخرى مثل الخلية الأولى الجماهيري (فقط بعد انقسام الخلية)، والكتلة الجافة الخلية الأخيرة (قبل انقسام الخلية) والخلية الجافة دورة مدتها، أي، والفترة الزمنية بين شعبتين على التوالي15. يمكن أن تحسب جميع هذه القياسات مع إحصاءات جيدة جداً (N > 1000) نظراً لمجال الرؤية الكبيرة عادة ما يسمح تحليل الخلايا 200 إلى 10,000 في عملية شراء واحدة خالية من العدسة.
من أجل شرح هذه المنهجية استناداً إلى الفحص المجهري خالية من عدسة الفيديو، يصف لنا بروتوكول رصد وقياس ثقافة خلية هيلا لأيام 2.7. تحليل البيانات من أربع خطوات عملية تقوم على التعمير المجسم متعدد الطول الموجي وتقسيم الخلية وخلية تتبع خوارزميات انقسام الخلية. ويتضح هنا أن القرار المكانية ومعدل الإطار سريع نسبيا (شراء واحدة كل 10 دقائق) التي تم الحصول عليها مع هذا الإعداد مجهرية خالية من عدسة الفيديو متوافق مع معيار خلية تتبع خوارزميات. تحليل كامل لمجموعة البيانات هذه النتائج في قياس 10,584 خلية المسارات عبر دورات خلية كاملة.
وباختصار، مجهرية خالية من عدسة الفيديو أداة قوية لرصد تلقائياً الآلاف من غير مسمى، وغير المتزامنة، وخلايا غير معدلة كل تجربة؛ كل خلية يتم تعقب على مدى عدة دورات الخلية. وهكذا توفر لدينا قياسات متوسط قيمة العديد من المعلمات في الخلية، ولكن الأهم من ذلك، تباين بين الخلية على عدد كبير من الخلايا.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذه الورقة، ونظهر أن الفحص المجهري خالية من عدسة الفيديو يمكن استخدامها داخل حاضنة لالتقاط حركية الآلاف من الخلايا. من أجل وصف المنهجية الشاملة التي شرحنا كيف يمكن تحليلها يوم 2.7 اكتساب الوقت الفاصل بين خلايا هيلا في الثقافة مع معيار خلية تتبع خوارزميات. والنتيجة هي إحدى وحدات dataset يضم 2…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب ليس الاعتراف لها.
Materials
| Cytonote lens-free video microscope | Iprasense | ||
| Horus acquisition software | Iprasense | ||
| 6-well glass bottom culture plates | MatTek corporation | Part No: P06G-0-14-F | |
| DMEM + GlutaMAX medium | Gibco | ||
| heat-inactivated fetal calf serum | Eurobio | ||
| penicillin and streptomycin | Gibco | ||
| Fibronectin | Sigma Aldrich | ||
| Matlab, image processing toolbox | Mathworks |
References
- Zangle, T. A., Teitell, M. A. Live-cell mass profiling: an emerging approach in quantitative biophysics. Nat Methods. 11 (12), 1221-1228 (2014).
- Popescu, G., Park, K., Mir, M., Bashir, R. New technologies for measuring single cell mass. Lab Chip. 14 (4), 646-652 (2014).
- Reed, J., et al. Rapid, massively parallel single-cell drug response measurements via live cell interferometry. Biophys J. 101 (5), 1025-1031 (2011).
- Mir, M., et al. Optical measurement of cycle-dependent cell growth. Proc Natl Acad Sci. USA. 108 (32), 13124-13129 (2011).
- Girshovitz, P., Shaked, N. T. Generalized cell morphological parameters based on interferometric phase microscopy and their application to cell life cycle characterization. Biomed Opt Express. 3 (8), 1757-1773 (2012).
- Kemper, B., Bauwens, A., Vollmer, A., Ketelhut, S., Langehanenberg, P. Label-free quantitative cell division monitoring of endothelial cells by digital holographic microscopy. J Biomed Opt. 15 (3), (2010).
- Mir, M., Bergamaschi, A., Katzenellenbogen, B. S., Popescu, G. Highly sensitive quantitative imaging for monitoring single cancer cell growth kinetics and drug response. PLoS One. 9 (2), 1-8 (2014).
- Bon, P., Savatier, J., Merlin, M., Wattellier, B., Monneret, S. Optical detection and measurement of living cell morphometric features with single-shot quantitative phase microscopy. J Biomed Opt. 17 (7), (2012).
- Aknoun, S., et al. Living cell dry mass measurement usinq quantitative phase imaging with quadriwave lateral shearing interferometry: an accuracy and sensitivity discussion. J Biomed Opt. 20 (1), 1-4 (2015).
- Cotte, Y., et al. Marker-free phase nanoscopy. Nature Photonics. 7 (2), 113-117 (2013).
- Choi, W., et al. Tomographic phase microscopy. Nat Methods. 4 (9), 717-719 (2007).
- Kesavan, S. V., et al. High-throughput monitoring of major cell functions by means of lensfree video microscopy. Sci Rep. 4, 1-11 (2014).
- Zheng, G., Lee, S. A., Antebi, Y., Elowitz, M. B., Yang, C. The ePetri dish, an on-chip cell imaging platform based on subpixel perspective sweeping microscopy (SPSM). Proc Natl Acad Sci USA. 108 (41), 16889-16894 (2011).
- Pushkarsky, I., et al. Automated single-cell motility analysis on a chip using lensfree microscopy. Sci Rep. 4, 4717 (2014).
- Allier, C., et al. Imaging of dense cell cultures by multiwavelength lens-free video microscopy. Cytom Part A. 91 (5), 1-10 (2017).
- Su, T. -. W., Seo, S., Erlinger, A., Ozcan, A. High-throughput lensfree imaging and characterization of a heterogeneous cell solution on a chip. Biotechnol Bioeng. 102 (3), 856-868 (2009).
- Delacroix, R., et al. Cerebrospinal fluid lens-free microscopy: a new tool for the laboratory diagnosis of meningitis. Sci Rep. 7, 39893 (2017).
- Tinevez, J. -. Y., et al. TrackMate: an open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2016).
- Popescu, G. Optical imaging of cell mass and growth dynamics. Am J Physiol Physiol. 295 (2), 538-544 (2008).
- Liu, P. Y., et al. Cell refractive index for cell biology and disease diagnosis: past, present and future. Lab Chip. 16, 634-644 (2016).
- Rapoport, D. H., Becker, T., Mamlouk, A. M., Schicktanz, S., Kruse, C. A novel validation algorithm allows for automated cell tracking and the extraction of biologically meaningful parameters. PLoS One. 6 (11), e27315 (2011).
- Al-Kofahi, O., et al. Automated cell lineage construction: A rapid method to analyze clonal development established with murine neural progenitor cells. Cell Cycle. 5 (3), 327-335 (2006).
- Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I., van Cappellen, W. A. Tracking in cell and developmental biology. Semin Cell Dev Biol. 20 (8), 894-902 (2009).
- Posakony, J. W., England, J. M., Attardi, G. Mitochondrial growth and division during the cell cycle in HeLa cells. J Cell Biol. 74 (2), 468-491 (1977).
- Zocchi, E., et al. Expression of CD38 Increases Intracellular Calcium Concentration and Reduces Doubling Time in HeLa and 3T3 Cells. J Biol Chem. 273 (14), 8017-8024 (1979).
- Reitzer, L. J., Wice, B. M., Kennell, D. Evidence that glutamine, not sugar, is the major energy source for cultured HeLa cells. J Biol Chem. 254 (8), 2669-2676 (1979).
- Benedetti, A. D. E., Joshi-barve, S., Rinker-Schaeffer, C., Rhoads, R. E. Expression of Antisense RNA against Initiation Factor eIF-4E mRNA in HeLa Cells Results in Lengthened Cell Division Times, Diminished Translation Rates, and Reduced Levels of Both eIF-4E and the p220 Component of eIF-4F. Mol Cell Biol. 11 (11), 5435-5445 (1991).
- Kumei, Y., Nakajima, T., Sato, A., Kamata, N., Enomoto, S. Reduction of G1 phase duration and enhancement of c-myc gene expression in HeLa cells at hypergravity. J Cell Sci. 93 (2), 221-226 (1989).
- Ginzberg, M. B., Kafri, R., Kirschner, M. On being the right (cell) size. Science. 348 (6236), 1245075 (2015).
- Mathieu, E., et al. Time-lapse lens-free imaging of cell migration in diverse physical microenvironments. Lab Chip. 16 (17), 3304-3316 (2016).
