Um protocolo para o desenvolvimento de um biosensor eletroquímico de DNA composta por um eletrodo de carbono ácido-estável, ouro de nanopartículas-modificado, serigrafado polilático para detectar o Vibrio parahaemolyticus é apresentado.
Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemolyticus) é um patógeno comum de intoxicação alimentar que contribui para uma grande parte dos problemas de saúde pública no mundo, afetando significativamente a taxa de morbidade e mortalidade humana. Métodos convencionais para a detecção de V. parahaemolyticus como métodos baseados em cultura, testes imunológicos e moleculares com base em métodos requerem manipulação de amostra complicado e são caro, demorado e tedioso. Recentemente, biosensores tem provado para ser um método de deteção promissora e abrangente com as vantagens da detecção rápida, custo-efetividade e praticidade. Esta pesquisa se concentra no desenvolvimento de um método rápido de detectar V. parahaemolyticus com alta seletividade e sensibilidade usando os princípios de hibridização de DNA. No trabalho, caracterização de nanopartículas ouro sintetizado polilático ácido-estabilizado (PLA-AuNPs) foi conseguida usando a difração de raios x (XRD), espectroscopia de ultravioleta-visível (UV-Vis), microscopia eletrônica de transmissão (TEM), de emissão de campo Microscopia eletrônica (FESEM) e voltametria cíclica (CV). Também realizamos ensaios de estabilidade, sensibilidade e reprodutibilidade do PLA-AuNPs. Nós achamos que o PLA-AuNPs formou uma estrutura sólida de nanopartículas estabilizadas em solução aquosa. Observou-se também que a sensibilidade melhorada como resultado o valor de resistência (Rct) de transferência de carga menor e um aumento da área de superfície ativa (0,41 cm2). O desenvolvimento da nossa biosensor DNA baseou-se na modificação de um eletrodo de carbono serigrafado (SPCE) com PLA-AuNPs e usando azul de metileno (MB) como indicador redox. Foram avaliados os eventos de imobilização e hibridação por voltametria de pulso diferencial (DPV). Descobrimos que complementar, não-complementares, e oligonucleotides incompatíveis especificamente foram distinguidos pelo biosensor fabricado. Também mostrou que confiantemente sensível deteção em estudos de reatividade cruzada contra vários patógenos de origem alimentar e na identificação de V. parahaemolyticus em berbigões frescos.
Um importante tópico de debate público e científico nos últimos anos, a intoxicação alimentar é principalmente associada com 3 agentes: microorganismos1, produtos químicos2e parasitas3. Alimentos contaminados podem causar consequências graves para a saúde nos seres humanos, especialmente no grupo de risco mais elevado das pessoas com fraco sistema imunológico, a mulheres grávidas, idosas, bebês e crianças pequenas4. Com mais de 1 milhão de casos de diarreia aguda, ocorrendo anualmente em crianças menores de 5 anos de idade na África, Ásia e América Latina, a intoxicação alimentar é das principais doenças global5,6 e estabeleceu-se a Organização Mundial da saúde microorganismos como o mais importante contribuinte7. Vibrio parahaemolyticus destaca-se entre as cepas virulentas mais amplamente reconhecidas. Geralmente encontrado em ambientes costeiros, estuarinos e marinhos8, é uma bactéria Gram-negativa, que se torna ativo em ambientes de sal elevados e provoca grave gastroenterite humana quando comidos em marine inadequadamente cozida, maltratado ou cru produtos9. Além disso, condições médicas existentes em algumas pessoas tornem propenso a ferida infecção, septicemia ou orelha infecção decorrentes de V. parahaemolyticus10. Os fatores de virulência de V. parahaemolyticus hemolisinas são divididos em dois tipos, que contribuem para a patogênese da doença: thermostable hemolisina directa (TDH) codificadas por genes tdh e hemolisina TDH-relacionados, codificadas por genes de trh11. Os marcadores de virulência (genes tdh e trh) de V. parahaemolyticus são normalmente encontrados em amostras clínicas em vez de amostras ambientais.
V. parahaemolyticus possui a habilidade de sobreviver em uma ampla gama de condições, responder rapidamente às mudanças ambientais12. Seu mecanismo de proliferação se agrava seu potencial de risco à medida que sua toxicidade aumenta em paralelo com a célula em massa13. Pior ainda, mudança climática está fornecendo estas bactérias com amplas condições para acelerar sua de crescimento de população celular14. Devido à sua alta frequência, V. parahaemolyticus necessita de ser acompanhada ao longo da cadeia de abastecimento alimentar, particularmente no comércio e na produção de frutos do mar, desde que esses produtos sejam onde eles são encontrados em quantidades enormes de15,16 em todo o mundo. Atualmente, as bactérias são identificadas e isolados, usando uma variedade de métodos, incluindo testes bioquímicos, enriquecimento e meios selectivos17, enzima-lig Fima adsorvente do ensaio (ELISA)18, eletroforese em gel de pulso-campo (PFGE) 19, testes de aglutinação de látex e de testes de reação em cadeia (PCR) polimerase20. Esses métodos normalmente requerem pessoal qualificado, instrumentos sofisticados e técnicas laboriosas que não fornecem informações sobre contaminação imediatamente. Isto limita severamente a probabilidade de detectar prontamente contaminação prejudicial e aplicações no local. Ferramentas de detecção rápida permanecem um desafio excepcional.
Biosensing está emergindo como uma opção promissora para a detecção de agentes patogénicos de origem alimentar, porque oferece uma economia de tempo, econômico, prático e em tempo real de análise método21,22,23,24 . No entanto, embora tenha havido muitos resultados positivos de detecção de analito em amostras cravadas e solução padrão usando biosensores, ainda há uma falta de pesquisa aplicada a amostras reais em misturas aquosas ou extractos orgânicos25. Recentemente, biosensores eletroquímicos detecção direta ou indireta de Ácido desoxirribonucleico (DNA) têm recebido atenção crescente entre os cientistas, devido a sua detecção específica do alvo complementar através de uma hibridização evento26 , 27 , 28 , 29. essas abordagens únicas são mais estáveis em comparação com biossensores enzimáticos, oferecendo assim uma tecnologia promissora para a miniaturização e comercialização. O alvo do estudo relatado aqui é construir uma ferramenta rápida que pode detectar V. parahaemolyticus com alta seletividade, sensibilidade e praticidade, baseada-se a especificidade de sequência de DNA durante a hibridação. Estratégias de identificação envolvem a combinação de polilático nanopartículas de ouro ácido-estabilizado (PLA-AuNPs)30 e os elétrodos do carbono serigrafado (SPCEs) na presença do indicador de hibridação, azul de metileno (MB). O potencial de construção de deteção desenvolvidos é mais explorado usando amostras de berbigão fresco e lisado de DNA de bactérias.
Os passos críticos em um quadro para o desenvolvimento bem sucedido deste tipo de biosensor eletroquímico são a seleção de elementos de reconhecimento biológico adequado para o transdutor (ácido nucleico ou DNA aqui); abordagem de química para a construção de camada de sensoriamento do transdutor; material de transdução; otimização de imobilização de DNA e hibridação; e validação do biosensor desenvolvido usando amostras reais.
Núcleo para o desenvolvimento bem sucedido de…
The authors have nothing to disclose.
Os autores gostaria de agradecer o apoio da Universiti Putra Malaysia.
Acetic acid | Merck | 100056 | |
Chloroform | Merck | 102445 | |
Diaminoethane tetraacetic acid | Promega | E5134 | |
Dibasic sodium phosphate | Sigma-Aldrich | S9763 | |
Disodium hydrogen phosphate | Sigma-Aldrich | 255793 | |
Ethanol | Sigma-Aldrich | 16368 | |
Gold (III) chloride trihydrate | Sigma-Aldrich | 520918 | |
Hydrochloric acid | Merck | 100317 | |
Methylene blue | Sigma-Aldrich | M44907 | |
Monobasic sodium phosphate, monohydrate | Sigma-Aldrich | S3522 | |
Phosphate-buffered saline | Sigma-Aldrich | P5119 | |
Poly(lactic acid) resin, commercial grade 4042D | NatureWorks | 4042D | |
Potassium chloride | R&M Chemicals | 59435 | |
Potassium dihydrogen phosphate | Sigma-Aldrich | P9791 | |
Potassium hexacyanoferrate III | R&M Chemicals | 208019 | |
Sodium acetate anhydrous salt | Sigma-Aldrich | S2889 | |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | |
Trisodium citrate | Sigma-Aldrich | S1804 | |
Tris(hydroxymethyl) aminomethane | Fisher Scientific | T395-100 | |
Tris-Base | Fisher Scientific | BP152-500 | |
2X PCR Master Mix with Dual-Dye | Norgen Biotek | 28240 | |
Agarose gel | Merck | 101236 | |
Bolton Agar | Merck | 100079 | |
Bolton Broth | Merck | 100079 | |
CHROMagar Vibrio | CHROMagar | VB910 | |
dNTPs | Promega | U1511 | |
Nuclease-free water | Thermo Scientific | R0581 | |
Eosin methylene blue agar | Merck | 101347 | |
GelRed | Biotium | 41001 | |
Glycerol | Merck | 104092 | |
Go Taq Buffer | Promega | M7911 | |
Loading dye 100 bp DNA ladder | Promega | G2101 | |
Loading dye 1kb DNA ladder | Promega | G5711 | |
Magnesium chloride | Promega | 91176 | |
Mannitol egg yolk polymyxin agar | Merck | 105267 | |
McConkey Agar | Merck | 105465 | |
Nutrient Broth | Merck | 105443 | |
Taq polymerase | Merck | 71003 | |
Trypticase Soy Broth | Merck | 105459 | |
Trypticase Soy Agar | Merck | 105458 |