세포질 구성 요소를 식별 하는 간단한 형광 기반 기자 분석 결과 리 독 소에 필요한 체인 (RTA) 효 모에 인신 매매
Summary
원고, 우리는 밀매에 관여 하 고 식물 독 소 리 (RTA)의 소 단위는 세포 독성의 프로세스를 죽이고 세포 구성 요소를 식별 하는 효 모 기반 형광 기자 분석 결과 사용 하 여를 설명 합니다.
Abstract
박테리아 및 식물 A B 독 소는 cytosol에서 그들의 세포내 별로 도달 하 고 궁극적으로 죽 진 핵 세포에서 자연 밀매 경로 악용 /. 이러한 A / B 독 소는 효소 활성의 Asubunit (예를 들어, 신은 독 소 (RTA)) 및 하나 이상의 셀 바인딩 Bsubunit(s) 독 소에 특정 바인딩 세포 표면 수용 체에 대 한 책임은 일반적으로 구성. 어떻게 우리의 현재 지식 A / B 독 소 효율적으로 endocytosis 및 세포내 단백질 높은 진 핵 세포에서 정렬 같은 기본적인 세포질 기계 장치를 이해 하기 도움이 셀 과학자를 취하게 할 수 있다. 의료의 관점에서 그것은 마찬가지로 환자에 대 한 적절 한 치료 솔루션을 찾을 수 또는 결국 암 치료에 대 한 치료 독 소-기반 응용 프로그램 개발에 주요 독 소 밀매 경로 식별 하는 것이 중요.
A의 게놈 넓은 분석 이후 / B 독 소 포유류 세포에서 인신 매매는, 시간이 걸리는, 복잡 하 고 비싼, A에 여러 연구 / B 독 소 전송 효 모 모델 유기 체 Saccharomyces cerevisiae에서 수행 되었습니다. 효 모와 더 높은 진 핵 세포에서 덜 복잡 하 고, 기본적인 세포질 과정 임에도 불구 하 고 비슷한과 효 모에 얻은 결과 매우 자주 포유류 상황에 전송할 수 있습니다.
여기, 우리 누 룩에서 RTA의 세포내 매매 분석을 신속 하 고 사용 하기 쉬운 기자 분석 결과 설명 합니다. 새로운 분석 결과의 필수적인 이점을 cytosol에 뿐만 아니라 RTA 복고풍-전 바인딩과 그물 (응급실)에서 조사를 기회 이지만 오히려 endocytosis 퇴행 성 독 소 수송 원형질 막에서 응급실에. 분석 결과 vivo에서 번역 후 녹색 형광 단백질 (GFP)의 형광 방출 통해 RTA 독성의 간접 측정을 허용 하는 기자 플라스 미드의 사용. RTA 28S rRNA depurination에 의해 효율적으로 단백질 생 합성의 개시를 방지, 이후이 분석 결과에서 수 있습니다 호스트 세포 단백질의 식별을 변경의 검색을 통해 세포내 RTA 전송에 관련 된 형광 방출.
Introduction
독 소를 생산 하는 박테리아에 의해 감염에서 고통 받는 환자 효율적인 치료 치료는 여전히 크게 실종 이후 특히 각 사회 의료 시스템에 대 한 심각한 의료 및 금융 부담을 나타냅니다. 새로운 치료 전략, 의학 관련 A의 복잡 한 중독 메커니즘 개발 / B 독 소 콜레라 독 소, 시가 독 소, 또는 리 등 완벽 하 게 구현할 수 있는 새로운 강력한 분석 실험에 따라 분자 수준에서 이해 될 필요가.
최근 몇 년 동안 여러 연구 A를 분석 하려고 / 효 모 및 방사성 독 소 같은 시간이 소요 되 고 비용 집약적인 메서드를 사용 하 여 포유류 세포에서 B 독 소 운송 라벨 siRNA 기반 심사로1,2 3을접근 한다. 경우에 따라 독 소 매매 시각 있다 vivo에서 형광 현미경 검사 법에 의해 fluorophores, 양자 점, 또는 형광 단백질4,5소 단위 개별 독 소의 화학 그리고/또한 유전 결합 후. 불행히도, 이러한 수정 종종 비활성 또는 변경 된 독 소의 자연 속성으로 이어질. 다양 한 과학적인 질문에 직접 답변을 또 다른 우아한 방법은 이다 lacZ, luciferase 등 형광 단백질 효소에 따라 기자 시스템의 사용 (예: GFP 또는 Discosoma sp. 빨간 형광 성 단백질 ( dsRed))입니다.
이 원고는 S. cerevisiae에 extracellularly 적용된 RTA의 세포내 수송에 필요한 세포질 구성 요소를 식별 하는 간단한 프로토콜 설명 합니다. 따라서, GFP 뒤 응급실 가져오기 N 맨끝 신호를 포함 하는 형광 기자 플라스 미드 GFP 형광 방출 후에 vivo에서 RTA 중재 단백질 번역 억제를 직접적으로 측정 하는 단백질 생 합성 센서 역 번역6. 경우는 RTA endocytosis 및 세포내 매매 부정적인 (또는 긍정적인) 영향을 야생-타입에 비해 특정 효 모 삭제 돌연변이에이 GFP 형광 방출6증가 (또는 감소)를 통해 감지할 수 있습니다.
지금까지, 모든 방법을 분석 하는 효 모 세포에서 RTA 전송 RTA의 응급실 cytosol 복고풍 전 프로세스에 제한 되었습니다. 이러한 인공 시스템에서 RTA는 응급실 가져오기 신호를 포함 하는 자살 형1,7에 결과 유도할 수 있는 발기인에서 표현 된다. 셀 리의 B 소 단위 바인딩 마찬가지로이 원고에 설명 된 실험 설정에서 누락 된 고, 따라서, 완전히 나타내지 않는 신은 holotoxin 중독8의 자연 상황, 독 소 전송 플라즈마에서 응급실에 Golgi 기구 통해 막이 소설 분석 결과와 밀접 하 게 유사 될 수 있습니다. 흥미롭게도, 파일럿 연구에서 얻은 예비 결과 RTA에서 사용 하는 밀매 경로 신은 holotoxin의 중독 경로와 눈에 띄는 유사성을 공개를 나타냅니다.
요약, 설명된 방법 RTA endocytosis에 선택한 세포 단백질 및 효 모에 인신 매매의 특정 역할을 결정 하기 위해 사용할 수 있습니다. 또한,이 실험적인 체제 생산과 다양 한 효 모와 세균 종 zymocin 또는 시가 독 소를 분 비 하는 독 소를 비활성화 다른 리보솜에 쉽게 적응 될 수도 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
위의 프로토콜을 수행할 때 실험의 성공적인 결과 달성 하기 위해 다음 제안 사항을 권장 합니다.
분리 단백질 식, 1 mM의 IPTG 농도 초과 하지 중요 하다. IPTG 농도 > 1mm 억제 발기인 유도 RTA 표현과 독 수익률 낮은 리드. 또한, 셀 수 없습니다 재배 포함 체 형성, 비효율적인 폴딩, 및 독 소 비활성화를 방지 하기 위해 28 ° C 보다 높은 온도에서. RTA 식 (예를 들어, 20-28 ° C)…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구의 부분을 친절 하 게 도이치 가운데 (SFB 1027, A6)에서 교부 금에 의해 지원 했다.
Materials
| Bacterial and yeast strains | |||
| E coli BL21 DE3(Gold) | Aligent Technologies | 230130 | |
| S. cerevisiae BY4742 | Euroscarf | Y10000 | |
| S. cerevisiae BY4742 deletion mutants | Dharmacon | YSC1054 | whole collection |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmids used in this protocol | |||
| pET24a(+) (Novagen) | Millipore | 69772-3 | |
| pET-RTA(His6) | Becker et al. (2016)3 | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Zymolyase 20T | USBio | Z1000.250 | lytic enzyme for cell wall removal |
| LB broth medium | Thermo Scientific | 10855021 | 15 g agar was added for plate production |
| YNB | Thermo Scientific | DF0335-15-9 | |
| Ammonium sulfate | Sigma-Aldrich | A4418-100G | |
| Yeast drop-out mix supplemts without leucine | Sigma-Aldrich | Y1376-20G | |
| Agar | Sigma-Aldrich | 05040-100G | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270-100G | |
| DTT | Sigma-Aldrich | 10197777001 | |
| D-raffinose | Sigma-Aldrich | 83400-25G | |
| D-sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876-1KG | |
| D-galactose | Sigma-Aldrich | G0750-10MG | |
| G418 | Thermo Scientific | 11811031 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758-1G | |
| Imidazole | Roth | 3899.1 | |
| PAGE ruler prestained | Fermentas | 26616 | protein ladder used for Western analysis |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material for RTA purification, desalting and reader measurements | |||
| Spectrophotometer Ultrospec 2100 pro | Amersham | ||
| Soniprep 150 | MSE | old model, other models available | |
| Fluoroskan Ascent | Thermo Scientific | 5210470 | old model, not available anymore |
| ÄKTAPurifier | Thermo Scientific | 28406266 | Product is discontinued and replaced |
| HisTRAP HP column | GE Healthcare | 17-5248-02 | |
| HiTRAP desalting column | GE Healthcare | 11-0003-29 | |
| Midisart sterile filter | Sartorius | 16534K | 0.2 µm pore size |
| BCA protein assay kit | Pierce | 23225 | |
| 660 nm assay kit | Thermo Scientific | 22660 | |
| 96 well plates | Thermo Scientific | 260860 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies (optional) | |||
| Anti-Tetra-His | Qiagen | 34670 | primary antibody; 1:1,000 dilution |
| Anti-mouse-HRP | Sigma-Aldrich | A9044-2ML | secondary antibody, 1:10,000 dilution |
References
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