كشف وإزالة التلوث Nuclease أثناء تنقية Integrase فيروس مزبد النموذج المؤتلف
Summary
هي غالباً ما تكون ملوثة البروتين integrase فيروس مزبد النموذج المؤتلف مع نوكلاس بكتيرية أثناء تنقية. هذا الأسلوب يعرف التلوث نوكلاس وإزالته من التحضير النهائي للانزيم.
Abstract
بروتين إينتيجراسي (في) لفي النموذج الفيروس مزبد (فف) إنزيم نموذج لدراسة إليه التكامل للفيروسات الرجعية. مقارنة من الفيروسات القهقرية الأخرى، في فف القابلة للذوبان أكثر وأكثر قابلية للمعالجة التجريبية. بالإضافة إلى ذلك، فإنه حساس لمثبطات في ذات الصلة سريرياً فيروس نقص المناعة البشرية (فيروس نقص المناعة البشرية-1)، مما يدل على أن الآلية الحفازة في فف مماثلة إلى أن من “تلبيتها،” فيروس نقص المناعة البشرية-1 يحفز التساهمية ضم الحمض النووي التكميلية الفيروسية (كدنا) للهدف ودعا الحمض النووي في عملية نقل حبلا. ويدخل هذا رد فعل نقل حبلا نيكس إلى الهدف الحمض النووي. يمكن مرتبك تحليل إدماج نواتج التفاعل بوجود نوكليسيس أن المثل نك الحمض النووي. لقد ثبت نوكلاس جرثومي لتنقية يشترك مع المؤتلف في فف المعرب عنها في الإشريكيّة القولونية (كولاي). هنا يصف لنا طريقة لعزل في فف من نوكلاس تلويث من الهيبارين التقارب اللوني. ويجري فرز الكسور بسهولة للتلوث نوكلياسي مع بلازميد سوبيركويليد و [اغروس] هلام التفريد. في بفف و nuclease تلويث عرض الانتماءات البديلة سيفاروسي الهيبارين مما يسمح إعداد خالية nuclease المؤتلف بفف في مناسبة لتحليل جزيء البيوكيميائية أو واحد الجزء الأكبر من التكامل.
Introduction
دراسات جزيء البيوكيميائية وواحد من تفاعلات البروتين مع الحمض النووي تتطلب البروتينات المؤتلف استثنائية نقية. تلوث نوكليسيس من البكتيريا يمكن أن تحجب نتائج هذه الاختبارات. تم العثور على نوكلاس تلويث في الأعمال التحضيرية للبروتينات المؤتلف الأكسجين الكاسح بروتوكاتيتشواتي-3 و 4-ديوكسيجيناسي (PCD) ونموذج مزبد الفيروس (فف) إينتيجراسي (في) المعزولة من الإشريكيّة القولونية (كولاي)1 , 2 , 3.
فحوصات التكامل للفيروس تعتمد على تحويل الحمض النووي سوبيركويليد للمنتجات رصدت أو الخطي كتدبير في النشاط4. خلال العدوى الخلوية ينضم في طرفي كدنا الفيروسية الكروماتين المضيف5. ويطلق على كل نهاية الانضمام إلى رد فعل نقل حبلا. فحوصات المؤتلف في النشاط قد ينضم إلى اثنين الحمض النووي ليغومرات محاكاة كدنا الفيروسية وينتهي إلى هدف الحمض النووي في تكامل منسقة رد فعل4،5،6،،من78. وبدلاً من ذلك قد المؤتلف في الانضمام إلى واحدة فقط من نهاية الحمض النووي في موقع نصف ذات صلة غير فسيولوجيا تكامل رد فعل9،10. عندما سوبيركويليد بلازميد الحمض النووي هو الهدف من التكامل، التكامل متضافرة منتجات خطيا الحمض النووي ومنتجات التكامل الموقع نصف الدوائر استرخاء. يتم تعريف هذه المنتجات رد فعل بقدرتهم النسبية على الحركة أثناء [اغروس] هلام التفريد1. إذا كان في المؤتلف تلويث نوكلاس، سيكون هناك دوائر استرخاء زائفة أو بلازميد ربما تطبق الخلط بين النتائج التجريبية. قد يكون المسمى ليغومرات الحمض النووي الفيروسي فلوريسسينتلي شكل قاطع تحديد المنتجات التكامل، بدلاً من المنتجات نوكلاس. ومع ذلك، في تفضل كثيرا سوبيركويليد الحمض النووي الأهداف؛ ويمكن أن تحرف أي خسارة في بلازميد سوبيركويليد إلى دوائر استرخاء أو الحمض النووي الخطي بتلويث نوكلاس النتائج وتفسير البيانات11. وبالتالي من الضروري إزالة nucleases البكتيرية من الفيروسات التراجعية في الأعمال التحضيرية.
في فف لها صلة مختلفة عن الهيبارين سيفاروسي مقارنة بال نوكلاس البكتيرية1. قد تكون مفصولة في فف ونوكلاس شطف تدرج خطي من الهيبارين سيفاروسي. عدم الكشف عن نوكلاس سهولة امتصاص الأشعة فوق البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية) 280 نانومتر ذروة أو الصوديوم التحليلية دوديسيل كبريتات polyacrylamide هلام التفريد (الحزب الديمقراطي الصربي صفحة). بدلاً من ذلك، يتم الكشف عن نوكلاس بمقايسة نشاط نوكلاس استخدام تحويل بلازميد سوبيركويليد إلى دوائر استرخاء أو المنتجات الخطية. يتم اختبار كل جزء بعد الهيبارين سيفاروسي اللوني لنشاط نوكلاس. في فف والملوث نوكلاس قد لا فرق في تقارب عن راتنج شاردة مونو-Q. هناك فرق صغيرة في تقارب عن الراتنج الموجبة مونو-S. ومع ذلك، لا يسمح القرار مونو-S نوكلاس البكتيرية وفي فف كفاءة فصل البروتينات. وفي نهاية المطاف، الهيبارين سيفاروسي انجذاب تطهير يقدم أفضل فصل نوكلاس البكتيرية من فف في وفي الاستفادة من حجم التحميل غير محدود.
اختبار لتلويث نوكلاس النشاط يمكن تكييفه مع غيرها من البروتينات. بروتين الفائدة من المحتمل أن يكون الخصائص تقارب البديلة مما في فف؛ ويجب تحديد الفرق في ربط خصائص البروتين الفائدة والملوث نوكلاس تجريبيا. قد تكون هذه المنهجية لتحديد التلوث nuclease تتكيف مع الراتنجات الأخرى بما في ذلك الموجبة مونو-S أو راتنجات تبادل شاردة مونو-Q. راتنجات التبادل الأيوني وتقارب قد توفر طريقة موثوقة لعزل بروتين المؤتلف من الفائدة من تلويث nucleases مع أي قيود على حجم البروتين خلال الفصل اللوني.
Protocol
Representative Results
Discussion
المؤتلف البروتينات التي تتفاعل مع الحمض النووي، مثل إصلاح الحمض النووي البروتينات، الزبالين الأكسجين لتطبيقات الميكروسكوب جزيء واحد، أو إينتيجراسيس للفيروسات الرجعية، ينبغي أن تكون خالية من تلوث جرثومي نوكليسيس2،3. قد يسبب ارتباكا هذه الملوثات تفسير الن…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
أيد هذا العمل AI099854 المعاهد الوطنية للصحة، و AI126742 إلى المفتاح.
Materials
| BL21/DE3 Rosetta E. coli | EMD Millipore | 70956-4 | |
| LB broth | EMD biosciences | 1.10285.0500 | |
| Ampicillin | Amresco | 0339 | |
| Chloramphenicol | Amresco | 0230 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| IPTG | Denville Scientific | CI8280 | |
| ZnCl2 | Sigma-Aldrich | 208086 | |
| Tris Ultra Pure | Gojira Fine Chemicals | UTS1003 | |
| NaCl | P212121 | RP-S23020 | |
| PMSF | Amresco | 0754 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I0250 | |
| DTT | P212121 | SV-DTT | |
| UltraPure EDTA | Invitrogen/Gibco | 15575 | |
| MgSO4 | Amresco | 0662 | |
| Agarose | Denville Scientific | CA3510 | |
| Ethidium bromide | Thermo Fisher Scientific | BP1302 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | G37-20 | |
| Ni-NTA Superflow | Qiagen | 30430 | |
| Heparin Sepharose 6 Fast Flow | GE Healthcare Life Sciences | 17-0998-01 | |
| HRV14 3C protease | EMD Chemicals | 71493-3 |
References
- Lopez, M. A., Mackler, R. M., Yoder, K. E. Removal of nuclease contamination during purification of recombinant prototype foamy virus integrase. J Virol Methods. 235, 134-138 (2016).
- Senavirathne, G., et al. Widespread nuclease contamination in commonly used oxygen-scavenging systems. Nat Methods. 12 (10), 901-902 (2015).
- Gunn, K. H., Marko, J. F., Mondragon, A. An orthogonal single-molecule experiment reveals multiple-attempt dynamics of type IA topoisomerases. Nat Struct Mol Biol. 24 (5), 484-490 (2017).
- Valkov, E., et al. Functional and structural characterization of the integrase from the prototype foamy virus. Nucleic Acids Res. 37 (1), 243-255 (2009).
- Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. . Retroviruses. , (1997).
- Li, M., Craigie, R. Processing of viral DNA ends channels the HIV-1 integration reaction to concerted integration. J Biol Chem. 280 (32), 29334-29339 (2005).
- Li, M., Mizuuchi, M., Burke, T. R., Craigie, R. Retroviral DNA integration: reaction pathway and critical intermediates. EMBO J. 25 (6), 1295-1304 (2006).
- Sinha, S., Grandgenett, D. P. Recombinant human immunodeficiency virus type 1 integrase exhibits a capacity for full-site integration in vitro that is comparable to that of purified preintegration complexes from virus-infected cells. J Virol. 79 (13), 8208-8216 (2005).
- Goodarzi, G., Im, G. J., Brackmann, K., Grandgenett, D. Concerted integration of retrovirus-like DNA by human immunodeficiency virus type 1 integrase. J Virol. 69 (10), 6090-6097 (1995).
- Vora, A. C., Grandgenett, D. P. Assembly and catalytic properties of retrovirus integrase-DNA complexes capable of efficiently performing concerted integration. J Virol. 69 (12), 7483-7488 (1995).
- Jones, N. D., et al. Retroviral intasomes search for a target DNA by 1D diffusion which rarely results in integration. Nat Commun. 7, 11409 (2016).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), (2012).
