Genetiskt kodade luciferas är en populär icke-invasiv reporter av genuttryck. Användning av en automatiserad längsgående luciferas imaging gas – och temperatur-optimerade recorder (ALLIGATOR) gör längsgående inspelning från självlysande celler under en lång rad villkor. Här visar vi hur ALLIGATOR får användas i samband med dygnsrytmen forskning.
Luciferas-baserade reportrar av cellulära genuttryck i utbredd användning både längsgående och slutpunkten analyser av biologisk aktivitet. I dygnsrytmen forskning, exempelvis ge klocka genfusioner med firefly luciferas upphov till robust rytmer i cellulära Mareld som kvarstår över många dagar. Tekniska begränsningar i samband med Fotomultiplikatorrör (PMT) eller konventionella mikroskopi-baserade metoder för Mareld kvantifiering har oftast krävt att celler och vävnader bibehållas under ganska icke-fysiologiska förhållanden under inspelning, med en kompromiss mellan sensitivitet och genomströmning. Här redovisar vi en förfining av föregående metoder som möjliggör långsiktiga Mareld imaging med hög känslighet och genomströmning som stöder ett brett utbud av kultur villkor, inklusive rörliga gas och fuktstyrning, och som accepterar många olika vävnadsodling tallrikar och fat. Denna automatiserade längsgående luciferas imaging gas – och temperatur-optimerade recorder (ALLIGATOR) också tillåter observation av rumsliga variationer i luciferas uttryck över en cell enskiktslager eller vävnad som inte snabbt kan iakttas av traditionella metoder. Vi belysa hur ALLIGATOR ger kraftigt ökad flexibilitet för detektion av luciferas aktivitet jämfört med befintliga metoder.
Användning av luciferases som reportrar av genuttryck och proteinaktiviteten har blivit en populär teknik i molekylära och cellulära biologi forskning. Detta är sant i fältet dygnsrytm där kineticsen av firefly luciferas syntes och katalytisk inaktivering är särskilt väl lämpade för rapportering de longitudinella förändringarna i genuttryck som uppstår över cirka 24 h dygnsrytm cykeln. Som sådan, är luciferas anställd som en dygnsrytm reporter inom ett brett spektrum av organismer, inklusive svampar, växter, flugor och däggdjur1,2,3,4.
När kvantifiera dygnsrytm gen uttryck i vitro, används ofta ett fotomultiplikatorn röret (PMT) att spela in signalen självlysande. PMT-baserade mätningar har begränsad flexibilitet dock vanligtvis att vara begränsad till en förutbestämd tallrik eller skål storlek. Det går även inte att samla in någon rumslig information från prover som övervakas med hjälp av en PMT, vilket kan leda till en förlust av information när imaging prover som visar rumslig variation i luciferas uttryck. Dessutom som PMT och tillhörande elektronik är benägna till fel när de utsätts för den befuktade miljön i en vanlig cell kultur inkubator, utförs längsgående luciferas inspelning med PMTs alltid i icke-fuktad inkubatorer. Följaktligen, cell kultur rätter måste vara förseglade lufttäta att förhindra vätskeförlust genom avdunstning och kultur media måste därför buffras med 3-(N– morpholino) propanesulfonic syra (moppar) eller 4-(2-hydroxietyl) -1- piperazineethanesulfonic syra (HEPES), i stället för den CO2/bicarbonate buffring system som fungerar på vivo och används rutinmässigt i däggdjur vävnadskultur.
Till följd av dessa begränsningar förlägger mätning av Mareld av PMTs vanligt snäva begränsningar på de villkor under vilka celler upprätthålls under experiment. Att övervinna dessa problem och även att öka utbudet av möjliga försöksbetingelser, använder vi en standard CO2/N2 170 L vävnadsodling inkubator som har anpassats genom tillsats av en vatten-kylda elektron-multiplikation kostnad – tillsammans enhet (elektrisk) kamera med anti mist optik och digital styrning av temperaturen och gas. Detta har kallats en automatiserad längsgående luciferas Imaging Gas och Temperature-Optimized Recorder eller ALLIGATOR. ALLIGATOR möjliggör väsentligen ökad flexibilitet av självlysande imaging, både för hög genomströmning avbildning av standard vävnadsodling plattor (upp till 6 x 96 – eller 384-bra plattor samtidigt) och även för icke-standardiserade vävnadsodling system, sådan som perfunderade celler odlas i ultrakalla enheter. Detta instrument möjliggör också imaging att uppstå befuktade villkor och med steglös reglering av både CO2 O2 partiella tryck samt och temperatur.
Protokollet nedan beskriver en metod för självlysande inspelning av däggdjursceller och vävnadsodling-system som använder en ALLIGATOR (hädanefter benämnd ‘Mareld inkubator’). Det bör dock noteras att systemet skulle vara väl lämpad till självlysande imaging och också, med några ändringar, fluorescerande imaging, i ett antal andra biologiska system och sammanhang.
Protokollet beskrivs här är för däggdjursceller kultur, båda perfunderade och statiska villkor. ALLIGATOR kan dock enkelt anpassas till andra modellsystem. Faktiskt, det har redan visat att ge en utmärkt plattform för samtidig övervakning av förflyttning, sömn och perifera gen uttryck rytmer i Drosophila melanogaster underhålls under konstant mörker15. Det noteras också att, beroende på applikation, kamera typer än de som nämns här kan vara lämpligt. Vi tänka oss att med lämpliga filter, en modifierad version av den nuvarande setup kan i princip användas för fluorescens kvantifiering.
De enda program som ALLIGATOR inte kanske är lämpligt är de för vilka särskilt hög rumslig upplösning krävs, t ex imaging spatiotemporal organisationen av PER2::LUC uttryck i organotypic skivor av däggdjurs suprachiasmatiska kärnan, eller andra små vävnad skivor.
ALLIGATOR möjliggör många experiment kan utföras som hittills inte har lätt uppnås genom konventionella inspelning tekniker. Jämfört med nuvarande metoder för mätning av Mareld, ger ALLIGATOR ökad flexibilitet i både typ av cell kultur maträtt eller bild som kan användas, externa media villkor, känslighet och processivity.
Detta är särskilt relevant i en tid när det finns en övergång från vanlig 2D cell kultur modeller mot 3D organoid och flöde kultur-system. Som sådan, förväntas det att ALLIGATOR ger en anpassningsbar metod genom vilken Mareld kan mätas över många dagar och veckor under en rad villkor.
The authors have nothing to disclose.
Vi vill tacka stenröse forskning för att arbeta med oss för att utveckla detta system, i synnerhet Mark Henson, Jeremy Graham och Joao Correia. Vi tackar också David Walesiska och Mirre Reddy för värdefull diskussion under konstruktionsfasen, samt Peter Laskey (tidigare i Hamamatsu) för att ordna lån av en demo kamera och David Wong för hans kritiska bidrag till manuskriptet.
DMEM (1x) + GlutaMAX | Gibco | 31966-021 | |
Hyclone FetalClone III Serum | GE Healthcare | SH30109.03 | |
Neurobasal medium | Thermofisher | 21103049 | basal medium |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A4919 | |
Catalase | Sigma | C40 | |
Glutathione | Sigma | G6013 | |
Insulin | Sigma | I1882 | |
Superoxide Dismutase | Sigma | S5395 | |
Holo-transferrin | Calbiochem | 616424 | |
T3 (triiodo-L-thyronine | Sigma | T6397 | |
L-Carnitine | Sigma | C7518 | |
Ethanolamine | Sigma | E9508 | |
D (+)-Galactose | Sigma | G0625 | |
Putrescine | Sigma | P5780 | |
Sodium Selenite | Sigma | S9133 | |
Corticosterone | Sigma | C2505 | |
Linoleic Acid | Sigma | L1012 | |
Linolenic Acid | Sigma | L2376 | |
Lipoic Acid | Sigma | T1395 | |
Progesterone | Sigma | P8783 | |
Retinol Acetate | Sigma | R7882 | |
Retinol, all trans | Sigma | 95144 | |
D,L-alpha-Tocopherol | Sigma | 95240 | |
D,L-alpha-Tocopherol acetate | Sigma | T3001 | |
Sodium Bicarbonate Solution | Sigma | S8761-100ML | |
GlutaMAX (100x) | Gibco | 35050-038 | |
Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
Galaxy 170R incubator | Eppendorf | CO17301001 | |
Luciferin | Biosynth | L-8220 | |
D -(+)-Glucose solution | Sigma | G8644-100ML | |
DMEM powder | Sigma | D5030 | |
MOPS | Sigma | PHG0007 | |
1 mm I.D. silicone tubing | GE Healthcare | 19-4692-01 | |
Elbow luer connector | Ibidi | 10802 | |
Male luer fittings | Ibidi | 10826 | |
Female luer fittings | Ibidi | 10825 | |
µ-slide luer I 0.6 | Ibidi | 80196 | |
BD plastipak 20ml syringe | Becton Dickinson | 300613 | |
1mm I.D. ETFE tubing | GE Healthcare | 18-1142-38 | |
PF670462 | Sigma | SML0795 | |
B27 Supplement (50x) | ThermoFisher | 17504044 | |
iXon Ultra EMCCD camera | Andor | iXon 888 | |
Fiji | ImageJ | N/A | |
Prism 7.0 | Graphpad Software | N/A | |
Trypan blue | Sigma | T8154 | |
Deltaphase Isothermal Pad | Braintree Scientific | 39DP | |
Heated neutral density filter | Cairn Research | Custom item | |
Osmomat 030 | Gonotech | Discontinued | |
300 mOsmol/kg calibration standard | Gonotech | 30.9.0020 | |
Measuring vessel | Gonotech | 30.9.0010 | |
Focusing cylinder | Cairn Research | Custom item | |
NE-1600 programmable syringe pump | Pump Systems inc. | NE-1600 | |
Andor Solis Software | Andor | N/A |