Genetisk kodet luciferase er en populær non-invasiv reporter af genekspression. Anvendelse af en automatiseret langsgående luciferase imaging gas – og temperatur-optimeret recorder (ALLIGATOR) gør det muligt for langsgående optagelse fra en bioluminescerende celler under en lang række betingelser. Her viser vi, hvordan ALLIGATOR kan anvendes i forbindelse med døgnrytmen forskning.
Luciferase-baserede reportere af cellulær genekspression er i udbredt brug i både længderetningen og end-point undersøgelser vedrørende af biologisk aktivitet. I døgnrytmen forskning, for eksempel, give ur gen fusioner med firefly luciferase anledning til robust rytmer i cellulære bioluminescens, der eksisterer i mange dage. Tekniske begrænsninger forbundet med photomultiplier rør (PMT) eller konventionelle mikroskopi-baserede metoder til bioluminescens kvantificering har typisk krævet, at celler og væv opretholdes under helt ikke-fysiologiske forhold under optagelse, med en trade-off mellem følsomhed og overførselshastighed. Her rapporterer vi en videreudvikling af tidligere metoder, der giver langsigtet bioluminescens imaging med høj følsomhed og produktivitet som understøtter en bred vifte af kultur betingelser, herunder variabel gas og fugtighed kontrol, og som accepterer mange forskellige vævskultur plader og retter. Denne automatiserede langsgående luciferase imaging gas – og temperatur-optimeret recorder (ALLIGATOR) også giver mulighed for observation af rumlige variationer i luciferase udtryk på tværs af en celle éncellelag eller væv, som ikke kan let iagttages af traditionelle metoder. Vi fremhæve, hvordan ALLIGATOR giver langt større fleksibilitet til påvisning af luciferase aktivitet sammenlignet med eksisterende metoder.
Brugen af luciferases som indberettere af genekspression og protein aktivitet er blevet en populær teknik i molekylær og cellulær biologi forskning. Dette er sandt i feltet døgnrytmen, hvor kinetik af firefly luciferase syntese og katalytisk inaktivering er særlig velegnet til rapportering af de langsgående ændringer i genekspression, der opstår over ca 24 h døgnrytmen cyklus. Som sådan er luciferase ansat som døgnrytmen reporter på tværs af en bred vifte af organismer, herunder svampe, planter, fluer og pattedyr1,2,3,4.
Når kvantificere døgnrytmen gen expression in vitro-, er en photomultiplier tube (PMT) almindeligt anvendt til at optage en bioluminescerende signalet. PMT-baserede målinger har begrænset fleksibilitet dog normalt at være begrænset til en forudbestemt tallerken eller fad størrelse. Det er heller ikke muligt at indsamle nogen geografisk information fra prøver overvåges ved hjælp af en ydelse, som kan føre til tab af oplysninger, når imaging prøver, der viser rumlige variation i luciferase udtryk. Som PMT og tilhørende elektronik er tilbøjelige til at fejl når de udsættes for fugtig miljø af en standard celle kultur inkubator, udføres langsgående luciferase optagelse ved hjælp af PMTs desuden altid i ikke-fugtet væksthuse. Følgelig, celle kultur retter skal være forseglet lufttæt til at forhindre vandtab gennem fordampning og kultur medier skal derfor være bufferet med 3-(N– morpholino) propanesulfonic syre (MOPPER) eller 4-(2-hydroxyethyl) -1- piperazineethanesulfonic syre (HEPES), snarere end CO2/bicarbonate buffer system, der fungerer i vivo og bruges rutinemæssigt i pattedyr vævskultur.
Som følge af disse begrænsninger placerer måling af bioluminescens af PMTs normalt stramme restriktioner på de betingelser, hvorunder celler bevares under eksperimenter. At overvinde disse problemer, og også at øge antallet af mulige forsøgsbetingelser, bruger vi en standard CO2/n2 170 L vævskultur inkubator, er blevet tilpasset ved tilsætning af en vand-kølet elektron-multiplikation Charge – sammen enhed (EMCCD) kamera med anti-tåge optik og digital styring af temperatur og gas niveauer. Dette er blevet døbt en automatiseret langsgående Luciferase Imaging Gas og Temperature-Optimized optager eller ALLIGATOR. ALLIGATOR giver mulighed for væsentligt øget fleksibilitet af en bioluminescerende imaging, både til høj overførselshastighed billeddannelse af standard vævskultur plader (op til 6 x 96 – eller 384-godt plader samtidig) og også for ikke-standard betalingsnumre vævskultur systemer, sådan som perfunderet celler dyrkes i mikrofluid enheder. Dette instrument giver også mulighed for imaging for at forekomme befugtet betingelser og med variabel kontrol af både CO2 og O2 partialtrykket samt temperatur.
Protokollen nedenfor beskriver en metode til en bioluminescerende optagelse af pattedyr celle og vævskultur systemer ved hjælp af en ALLIGATOR (herefter benævnt ‘bioluminescens kuvøse’). Det skal bemærkes, at systemet ville være velegnet til en bioluminescerende imaging og også med nogle ændringer, fluorescerende imaging, i en række andre biologiske systemer og sammenhænge.
Protokollen beskrevet her er for pattedyr cellekultur, begge perfunderet og statiske betingelser. Dog kan ALLIGATOR let tilpasses til andre modelsystemer. Faktisk, det har allerede vist sig at give en fremragende platform til samtidig overvågning af bevægelse, søvn og perifere gen expression rytmer i Drosophila melanogaster vedligeholdes under konstant mørke15. Det bemærkes også, at afhængigt af programmet, kan være et passende kamera typer end dem, der er nævnt her. Vi forestiller os, at med de passende filtre, en modificeret version af den nuværende opsætning kunne principielt anvendes til fluorescens kvantificering.
De eneste programmer som ALLIGATOR ikke ville være passende er dem som særlig stor rumlig opløsning der kræves, såsom billedbehandling af spatiotemporelle organisation af PER2::LUC udtryk i organotypic skiver af pattedyr suprachiasmatic kernen, eller andre små væv skiver.
ALLIGATOR giver mange eksperimenter skal udføres, som hidtil ikke har været let opnåelige af konventionelle optagelse teknikker. Sammenlignet med nuværende metoder til måling af bioluminescens, giver ALLIGATOR øget fleksibilitet i både typen celle kultur parabol eller dias, der kan anvendes, eksternt medie betingelser, følsomhed og processivity.
Dette er særlig relevant på et tidspunkt, når der er en bevægelse væk fra standard 2D celle kultur modeller mod 3D organoid og flow kultur systemer. Det forventes, at ALLIGATOR vil give en fleksibel metode hvorved bioluminescens kan måles over mange dage og uger under en lang række betingelser.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne takke Cairn forskning for at arbejde sammen med os at udvikle dette system, især Mark Henson, Jeremy Graham og Joao Correia. Vi takker også David Walisisk og Akhilesh Reddy for værdifuld diskussion under konstruktionsfasen, samt Peter Laskey (tidligere af Hamamatsu) for at arrangere lån af en demo kamera og David Wong for hans kritiske input til manuskriptet.
DMEM (1x) + GlutaMAX | Gibco | 31966-021 | |
Hyclone FetalClone III Serum | GE Healthcare | SH30109.03 | |
Neurobasal medium | Thermofisher | 21103049 | basal medium |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A4919 | |
Catalase | Sigma | C40 | |
Glutathione | Sigma | G6013 | |
Insulin | Sigma | I1882 | |
Superoxide Dismutase | Sigma | S5395 | |
Holo-transferrin | Calbiochem | 616424 | |
T3 (triiodo-L-thyronine | Sigma | T6397 | |
L-Carnitine | Sigma | C7518 | |
Ethanolamine | Sigma | E9508 | |
D (+)-Galactose | Sigma | G0625 | |
Putrescine | Sigma | P5780 | |
Sodium Selenite | Sigma | S9133 | |
Corticosterone | Sigma | C2505 | |
Linoleic Acid | Sigma | L1012 | |
Linolenic Acid | Sigma | L2376 | |
Lipoic Acid | Sigma | T1395 | |
Progesterone | Sigma | P8783 | |
Retinol Acetate | Sigma | R7882 | |
Retinol, all trans | Sigma | 95144 | |
D,L-alpha-Tocopherol | Sigma | 95240 | |
D,L-alpha-Tocopherol acetate | Sigma | T3001 | |
Sodium Bicarbonate Solution | Sigma | S8761-100ML | |
GlutaMAX (100x) | Gibco | 35050-038 | |
Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
Galaxy 170R incubator | Eppendorf | CO17301001 | |
Luciferin | Biosynth | L-8220 | |
D -(+)-Glucose solution | Sigma | G8644-100ML | |
DMEM powder | Sigma | D5030 | |
MOPS | Sigma | PHG0007 | |
1 mm I.D. silicone tubing | GE Healthcare | 19-4692-01 | |
Elbow luer connector | Ibidi | 10802 | |
Male luer fittings | Ibidi | 10826 | |
Female luer fittings | Ibidi | 10825 | |
µ-slide luer I 0.6 | Ibidi | 80196 | |
BD plastipak 20ml syringe | Becton Dickinson | 300613 | |
1mm I.D. ETFE tubing | GE Healthcare | 18-1142-38 | |
PF670462 | Sigma | SML0795 | |
B27 Supplement (50x) | ThermoFisher | 17504044 | |
iXon Ultra EMCCD camera | Andor | iXon 888 | |
Fiji | ImageJ | N/A | |
Prism 7.0 | Graphpad Software | N/A | |
Trypan blue | Sigma | T8154 | |
Deltaphase Isothermal Pad | Braintree Scientific | 39DP | |
Heated neutral density filter | Cairn Research | Custom item | |
Osmomat 030 | Gonotech | Discontinued | |
300 mOsmol/kg calibration standard | Gonotech | 30.9.0020 | |
Measuring vessel | Gonotech | 30.9.0010 | |
Focusing cylinder | Cairn Research | Custom item | |
NE-1600 programmable syringe pump | Pump Systems inc. | NE-1600 | |
Andor Solis Software | Andor | N/A |