לוציפראז מקודדים גנטית הוא עיתונאי לא פולשנית הפופולרי של ביטוי גנים. שימוש לוציפראז האורך אוטומטית הדמיה מקליט גז, טמפרטורה-אופטימיזציה (תנין) מאפשר הקלטה אורכית מתאי זוהרים תחת מגוון רחב של מצבים. הנה אנחנו מראים איך תנין עשוי לשמש בהקשר של מחקר השעון הביולוגי.
מבוסס לוציפראז כתבים של ביטוי גנים הסלולר נמצאים בשימוש נרחב עבור שניהם האורך, מבחני מובילים של פעילות ביולוגית. במחקר השעון הביולוגי, לדוגמה, שעון fusions ג’ין עם גחלילית לוציפראז להצמיח מקצבים חזקים ב ביולומינסנציה הסלולר אשר נמשכות ימים רבים. מגבלות טכניות הקשורות האופטיקה צינורות (PMT) או שיטות קונבנציונליות מבוסס מיקרוסקופיה על כימות ביולומינסנציה בדרך כלל דרשו כי תאים ורקמות להישמר בתנאים די הלא-פיזיולוגיים במהלך הקלטה, עם פשרה בין רגישות והתפוקה. כאן, אנחנו מדווחים עידון של שיטות מוקדמת מאפשרת הדמיה ביולומינסנציה לטווח ארוך עם רגישות גבוהה ותפוקת אשר תומכת במגוון רחב של תנאי תרבות, כולל בקרת לחות, והגז משתנה ומקבל את זה רבים שונים תרביות רקמה צלחות ומנות. לוציפראז האורך אוטומטיות זה הדמיה מקליט גז, טמפרטורה-אופטימיזציה (תנין) גם מאפשר התבוננות וריאציות המרחבי בביטוי לוציפראז דרך חד שכבתי תאים או רקמות, אשר לא יכול בקלות להיות שנצפו על ידי מסורתי שיטות. אנחנו מדגישים כמה התנין מספק גמישות ומעמד איתור פעילות לוציפראז בהשוואה שיטות קיימות.
השימוש luciferases ככתבים של ביטוי גנים, פעילות החלבון הפך טכניקה פופולרית במחקר הביולוגיה המולקולרית, התאית. זה נכון בשדה היממה, איפה קינטיקה של גחלילית לוציפראז סינתזה, איון קטליטי מותאמים במיוחד גם דיווח על האורך שינויים בביטוי הגנים המתרחשים לאורך המחזור כ 24 שעות היממה h. ככזה, לוציפראז הוא מועסק בתור כתבת היממה על פני מגוון רחב של אורגניזמים, כולל פטריות, צמחים, זבובים יונקים1,2,3,4.
כאשר לכימות ג’ין היממה ביטוי במבחנה, צינור האופטיקה (PMT) משמש בדרך כלל כדי להקליט את האות זוהרים. מדידות מבוסס-PMT מוגבלת גמישות לעומת זאת, בדרך כלל מוגבלת לחור בגודל צלחת או תבשיל שנקבע מראש. . זה גם לא אפשרי לאסוף מידע מרחבי מדגימות פיקוח באמצעות PMT, אשר יכול להוביל לאובדן של מידע כאשר הדמיה דוגמאות המציגות וריאציה המרחבי בביטוי לוציפראז יתר על כן, כפי PMT ואלקטרוניקה המשויך נוטים תקלה כאשר הם נחשפים הסביבה humidified של חממה התרבות תאים סטנדרטית, הקלטה אורכית לוציפראז באמצעות PMTs תמיד מתבצע על חממות שאינם humidified. וכתוצאה מכך תא תרבות מנות חייבים להיות אטומים לאוויר כדי למנוע אובדן לחות על-ידי התאדות, התקשורת תרבות ולכן חייב לאגור עם 3 – חומצה propanesulfonic (N– מורפולינו) (MOPS) או 4-(2-hydroxyethyl)-1- חומצה piperazineethanesulfonic (HEPES), ולא את /bicarbonate2CO אגירה מערכת מתפקדת ויוו ומשמשת באופן שגרתי בתרבות רקמה יונקים.
בשל מגבלות אלו, מדידה של ביולומינסנציה מאת PMTs בדרך כלל ממקמת הגבלות קפדניות על התנאים בהם תאים נשמרים במהלך הניסויים. כדי להתגבר על בעיות אלה, וגם כדי להגדיל את מגוון תנאי הניסוי אפשרי, אנו משתמשים על תקן CO2/N2 170 L תרביות רקמה חממה זה הותאם על ידי הוספת מקורר מים אלקטרון-הכפלת המצלמה תשלום מצמידים מכשיר (EMCCD) עם ערפל נגד אופטיקה ובקרה דיגיטלית של רמות טמפרטורה וגז. זה מכונה אוטומטית האורך לוציפראז הדמיה גז, Temperature-Optimized מקליט, או תנין. התנין מאפשר גמישות מוגברת באופן משמעותי של ביולומנאסן הדמיה, הן עבור תפוקה גבוהה הדמיה של תרביות רקמה סטנדרטי צלחות (עד 6 x 96 – או 384-ובכן פלטות בו זמנית), גם עבור מערכות תרביות רקמה שאינם סטנדרטיים, כזה כתאים perfused גדל microfluidic התקנים. כלי זה מאפשר גם הדמיה להתרחש בתנאים humidified ועם שליטה משתנה הן CO2 לחץ חלקי של2 O וכן טמפרטורה.
להלן הפרוטוקול מתאר שיטה עבור ההקלטה ביולומנאסן בתרבית של תאים ומערכות תרביות רקמה באמצעות תנין (המכונה מעתה ‘ביולומינסנציה חממה’). יצוין, עם זאת, כי המערכת תהיה מתאימה כדי ביולומנאסן הדמיה וגם, עם כמה שינויים, פלורסנט הדמיה, במספר מערכות ביולוגיות והקשרים אחרים.
פרוטוקול המתואר כאן הוא לתרבות בתרבית של תאים, שניהם תחת תנאים perfused וסטטיים. עם זאת, התנין בקלות ניתן להתאים למערכות אחרות מודל. ואכן, כבר הוכח כדי לספק פלטפורמה מצוינת לפיקוח הסימולטניות של גפיים, שינה ומקצבים ביטוי גנים היקפי ב- דרוזופילה melanogaster מתוחזקים תחת חשיכה מתמדת15. הוא גם ציין כי, בהתאם ליישום, סוגי המצלמה חוץ מזה שהוזכרו כאן עשוי להיות מתאים. אנחנו הסתברותיות כי עם המסננים המתאימים, גירסה שונה של הכיוונון הנוכחי יכול המנהל לשמש על ידי קרינה פלואורסצנטית כימות.
היישומים רק עבורם התנין לא הולמת הם אלה אשר רזולוציה מרחבית גבוהה במיוחד נדרש, כגון הדמיה של הארגון ייתכן הביטוי PER2::LUC organotypic פרוסות של מידע יונקים העל-תצלובתי או לפרוסות קטנות רקמות אחרות.
התנין מאפשר ניסויים רבים שיש לבצע, כי עד כה לא היו השגה בקלות על ידי טכניקות הקלטה קונבנציונלי. לעומת שיטות לשקילת ביולומינסנציה, התנין מספק גמישות הן סוג של מאכל התרבות התא או שקופיות שניתן להשתמש בהם, מדיה חיצוני תנאים, רגישות ו processivity.
זה רלוונטי במיוחד בכל פעם כאשר יש מהלך מן תא 2D סטנדרטי מודלים תרבות כלפי מערכות התרבות תלת-ממד של תא צורב וזרימה. ככזה, הוא צפוי כי התנין תספק שיטת וישימה שבאמצעותו ניתן למדוד ביולומינסנציה במשך ימים ושבועות רבים תחת מגוון רחב של מצבים.
The authors have nothing to disclose.
ברצוננו להודות Cairn מחקר על העבודה המשותפת אתנו במטרה לפתח מערכת זו, בפרט מארק הנסון, ג’רמי גרהאם, ז’ואו להכיר. אנחנו גם תודה דוד ולשי ו מיכל ירקוני Reddy לדיון חשוב במהלך שלב העיצוב, כמו גם פיטר לסקי (לשעבר של המלונות בהם צפיתי) הסדרת ההלוואה של המצלמה הדגמה דיוויד וונג עבור הקלט הקריטי שלו כתב היד.
DMEM (1x) + GlutaMAX | Gibco | 31966-021 | |
Hyclone FetalClone III Serum | GE Healthcare | SH30109.03 | |
Neurobasal medium | Thermofisher | 21103049 | basal medium |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A4919 | |
Catalase | Sigma | C40 | |
Glutathione | Sigma | G6013 | |
Insulin | Sigma | I1882 | |
Superoxide Dismutase | Sigma | S5395 | |
Holo-transferrin | Calbiochem | 616424 | |
T3 (triiodo-L-thyronine | Sigma | T6397 | |
L-Carnitine | Sigma | C7518 | |
Ethanolamine | Sigma | E9508 | |
D (+)-Galactose | Sigma | G0625 | |
Putrescine | Sigma | P5780 | |
Sodium Selenite | Sigma | S9133 | |
Corticosterone | Sigma | C2505 | |
Linoleic Acid | Sigma | L1012 | |
Linolenic Acid | Sigma | L2376 | |
Lipoic Acid | Sigma | T1395 | |
Progesterone | Sigma | P8783 | |
Retinol Acetate | Sigma | R7882 | |
Retinol, all trans | Sigma | 95144 | |
D,L-alpha-Tocopherol | Sigma | 95240 | |
D,L-alpha-Tocopherol acetate | Sigma | T3001 | |
Sodium Bicarbonate Solution | Sigma | S8761-100ML | |
GlutaMAX (100x) | Gibco | 35050-038 | |
Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
Galaxy 170R incubator | Eppendorf | CO17301001 | |
Luciferin | Biosynth | L-8220 | |
D -(+)-Glucose solution | Sigma | G8644-100ML | |
DMEM powder | Sigma | D5030 | |
MOPS | Sigma | PHG0007 | |
1 mm I.D. silicone tubing | GE Healthcare | 19-4692-01 | |
Elbow luer connector | Ibidi | 10802 | |
Male luer fittings | Ibidi | 10826 | |
Female luer fittings | Ibidi | 10825 | |
µ-slide luer I 0.6 | Ibidi | 80196 | |
BD plastipak 20ml syringe | Becton Dickinson | 300613 | |
1mm I.D. ETFE tubing | GE Healthcare | 18-1142-38 | |
PF670462 | Sigma | SML0795 | |
B27 Supplement (50x) | ThermoFisher | 17504044 | |
iXon Ultra EMCCD camera | Andor | iXon 888 | |
Fiji | ImageJ | N/A | |
Prism 7.0 | Graphpad Software | N/A | |
Trypan blue | Sigma | T8154 | |
Deltaphase Isothermal Pad | Braintree Scientific | 39DP | |
Heated neutral density filter | Cairn Research | Custom item | |
Osmomat 030 | Gonotech | Discontinued | |
300 mOsmol/kg calibration standard | Gonotech | 30.9.0020 | |
Measuring vessel | Gonotech | 30.9.0010 | |
Focusing cylinder | Cairn Research | Custom item | |
NE-1600 programmable syringe pump | Pump Systems inc. | NE-1600 | |
Andor Solis Software | Andor | N/A |