Genetisk kodet luciferase er populære ikke-invasiv reporter av genuttrykk. Bruk av et automatisert langsgående luciferase imaging gass – og temperatur-optimalisert opptaker (ALLIGATOR) gjør langsgående opptak fra bioluminescent cellene under en rekke forhold. Her viser vi hvordan ALLIGATOR kan brukes i forbindelse med døgnrytme forskning.
Luciferase-baserte journalister av mobilnettet genuttrykk er i utstrakt bruk både langsgående end-point søk biologiske aktivitet. I døgnrytme forskning, for eksempel gi klokken genet fusjoner med firefly luciferase opphav til robust rytmer i mobilnettet bioluminescens som vedvarer over mange dager. Tekniske begrensninger knyttet photomultiplier rør (avdrag) eller konvensjonelle mikroskopi-baserte metoder for bioluminescens kvantifisering har vanligvis krevde at celler og vev opprettholdes under ganske ikke-fysiologiske forhold under opptak, med en avveining mellom følsomhet og gjennomstrømning. Her rapporterer vi en avgrensning av tidligere metoder som gjør at langsiktige bioluminescens bildebehandling med høy følsomhet og produksjon som støtter en rekke kultur forhold, herunder variabel gass og fuktighetskontroll, og som aksepterer mange forskjellige vev kultur platene og retter. Denne automatiserte langsgående luciferase imaging gass – og temperatur-optimalisert opptaker (ALLIGATOR) også lar observasjon av romlige variasjoner i luciferase uttrykk over en celle monolayer eller vev, som ikke kan lett observeres av tradisjonelle metoder. Vi markere hvordan ALLIGATOR gir langt større fleksibilitet for påvisning av luciferase aktivitet sammenlignet med eksisterende metoder.
Bruk av luciferases som journalister av genuttrykk og protein aktivitet har blitt en populær teknikk i molekylær og cellulær biologi forskning. Dette gjelder i feltet circadian, hvor the kinetics av firefly luciferase syntese og katalytisk inaktivering er spesielt godt egnet til rapportering langsgående endringer i genuttrykk som oppstår over ca 24 h circadian syklusen. Slik er luciferase ansatt som circadian reporter over et bredt spekter av organismer, inkludert sopp, planter, fluer og pattedyr1,2,3,4.
Når kvantifisere circadian genet uttrykk i vitro, brukes vanligvis et photomultiplier rør (betaling) å ta opp bioluminescent signalet. AVDRAG-baserte målinger har begrenset fleksibilitet men vanligvis begrenses til en forhåndsbestemt plate eller rett størrelse. Det er heller ikke mulig å samle romlig informasjon fra prøver overvåket ved hjelp av en innbetaling, som kan føre til tap av informasjon når imaging eksempler som viser romlige variasjon i luciferase uttrykk. Som avdrag og tilknyttede elektronikk er utsatt for feil når de utsettes for fuktet miljøet i en standard celle kultur inkubator, utføres videre alltid langsgående luciferase innspilling med PMTs i ikke-fuktet inkubatorer. I følge celle kultur retter må tettes lufttett å hindre tap av fuktighet gjennom fordamping og kultur media må derfor bufres med 3-(N– morpholino) propanesulfonic syre (MOPPER) eller 4-(2-hydroxyethyl) -1- piperazineethanesulfonic syre (HEPES), i stedet for CO2/bicarbonate bufring system som fungerer i vivo og brukes rutinemessig i pattedyr vev kultur.
Som følge av disse begrensningene begrensninger måling av bioluminesens av PMTs vanligvis tett på betingelsene som vedlikeholdes celler under eksperimenter. Å overvinne disse problemene og også øker mulig eksperimentelle forhold, bruker vi en standard CO2/N2 170 L vev kultur inkubator som har blitt tilpasset ved tilsetning av en vann-kjølt elektron-multiplisere kostnad – sammen enhet (EMCCD) kameraet med anti-tåke optikk og digital kontroll av temperatur og gass. Dette har blitt kalt en automatisert langsgående Luciferase Imaging-gass og Temperature-Optimized-opptaker eller ALLIGATOR. ALLIGATOR gir betydelig økt fleksibilitet bioluminescent Imaging, både for høy gjennomstrømming avbilding av standard vev kultur plater (opptil 6 x 96 – eller 384-godt plater samtidig) og også for ikke-standard vev kultur systemer, slik som perfused celler dyrket i microfluidic enheter. Dette kan også å oppstå under fuktet forhold og variabel kontroll av både CO2 og O2 delvis trykk samt temperatur.
Protokollen nedenfor beskriver en metode for bioluminescent opptak av pattedyr celler og vev kultur-systemer som bruker en ALLIGATOR (heretter referert til som ‘bioluminescens inkubator’). Det bemerkes imidlertid at systemet ville være godt egnet bioluminescent bildebehandling og også med noen endring, lysstoffrør imaging, i mange andre biologiske systemer og sammenhenger.
Protokollen beskrevet her er for pattedyr cellekultur, både under perfused og statisk forhold. Imidlertid kan ALLIGATOR lett tilpasses andre modellsystemer. Faktisk har det allerede vist å gi en utmerket plattform for samtidig overvåking av bevegelse, sove og eksterne gene expression rytmer i Drosophila melanogaster vedlikeholdes under konstant mørke15. Det er også bemerket at avhengig av programmet, kameraet typer enn det som er nevnt her kan være riktig. Vi ser at med riktige filtrene, en modifisert versjon av gjeldende oppsett kan i prinsippet brukes til fluorescens kvantifisering.
De eneste programmene som ALLIGATOREN ikke kanskje riktig er de som spesielt høy romlig oppløsning kreves, for eksempel bildebehandling for spatiotemporal av PER2::LUC uttrykk i organotypic skiver av pattedyr suprachiasmatic kjernen eller andre små vev sektorene.
ALLIGATOR kan mange eksperimenter utføres som hittil ikke er lett oppnåelig med konvensjonell brenning. Sammenlignet med dagens metoder for måling av bioluminescens, gir ALLIGATOR økt fleksibilitet i både type celle kultur parabol eller lysbildet som kan brukes, eksterne medier forhold, følsomhet og processivity.
Dette gjelder spesielt i en tid når det er en bevegelse bort fra standard 2D celle kultur modeller mot 3D organoid og flyt kultur systemer. Som sådan, er det forventet at ALLIGATOR vil gi en praktisk metode som bioluminescens kan måles over mange dager og uker under en rekke forhold.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gjerne takke Cairn forskning for samarbeidet med å utvikle dette systemet, spesielt Mark Henson, Jeremy Graham og Joao Correia. Vi har også takke Dave Welsh og Akhilesh rødlig for verdifulle diskusjon under designfasen, samt Peter Laskey (tidligere av Hamamatsu) for å arrangere lån av en demo kamera og David Wong for hans kritiske inndata i manuskriptet.
DMEM (1x) + GlutaMAX | Gibco | 31966-021 | |
Hyclone FetalClone III Serum | GE Healthcare | SH30109.03 | |
Neurobasal medium | Thermofisher | 21103049 | basal medium |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A4919 | |
Catalase | Sigma | C40 | |
Glutathione | Sigma | G6013 | |
Insulin | Sigma | I1882 | |
Superoxide Dismutase | Sigma | S5395 | |
Holo-transferrin | Calbiochem | 616424 | |
T3 (triiodo-L-thyronine | Sigma | T6397 | |
L-Carnitine | Sigma | C7518 | |
Ethanolamine | Sigma | E9508 | |
D (+)-Galactose | Sigma | G0625 | |
Putrescine | Sigma | P5780 | |
Sodium Selenite | Sigma | S9133 | |
Corticosterone | Sigma | C2505 | |
Linoleic Acid | Sigma | L1012 | |
Linolenic Acid | Sigma | L2376 | |
Lipoic Acid | Sigma | T1395 | |
Progesterone | Sigma | P8783 | |
Retinol Acetate | Sigma | R7882 | |
Retinol, all trans | Sigma | 95144 | |
D,L-alpha-Tocopherol | Sigma | 95240 | |
D,L-alpha-Tocopherol acetate | Sigma | T3001 | |
Sodium Bicarbonate Solution | Sigma | S8761-100ML | |
GlutaMAX (100x) | Gibco | 35050-038 | |
Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
Galaxy 170R incubator | Eppendorf | CO17301001 | |
Luciferin | Biosynth | L-8220 | |
D -(+)-Glucose solution | Sigma | G8644-100ML | |
DMEM powder | Sigma | D5030 | |
MOPS | Sigma | PHG0007 | |
1 mm I.D. silicone tubing | GE Healthcare | 19-4692-01 | |
Elbow luer connector | Ibidi | 10802 | |
Male luer fittings | Ibidi | 10826 | |
Female luer fittings | Ibidi | 10825 | |
µ-slide luer I 0.6 | Ibidi | 80196 | |
BD plastipak 20ml syringe | Becton Dickinson | 300613 | |
1mm I.D. ETFE tubing | GE Healthcare | 18-1142-38 | |
PF670462 | Sigma | SML0795 | |
B27 Supplement (50x) | ThermoFisher | 17504044 | |
iXon Ultra EMCCD camera | Andor | iXon 888 | |
Fiji | ImageJ | N/A | |
Prism 7.0 | Graphpad Software | N/A | |
Trypan blue | Sigma | T8154 | |
Deltaphase Isothermal Pad | Braintree Scientific | 39DP | |
Heated neutral density filter | Cairn Research | Custom item | |
Osmomat 030 | Gonotech | Discontinued | |
300 mOsmol/kg calibration standard | Gonotech | 30.9.0020 | |
Measuring vessel | Gonotech | 30.9.0010 | |
Focusing cylinder | Cairn Research | Custom item | |
NE-1600 programmable syringe pump | Pump Systems inc. | NE-1600 | |
Andor Solis Software | Andor | N/A |