동맥 경화 증의 영상에 대 한 펩 티 드 Amphiphile Micelles Monocyte 타겟팅의 합성
Summary
이 종이 합성 및 펩 티 드 amphiphile micelles monocyte 대상의 특성을 포함 하는 메서드를 제공 하 고 해당 생체 적합성 및 monocytes에 바인딩할는 micelle의 능력에 대 한 테스트 분석 실험.
Abstract
동맥 경화는 매년 17.3 백만 생활을 요구 하는 심혈 관 질환, 세계, 죽음의 주요 원인에 큰 기여. 동맥 경화는 급 사, 심근 경색, 불안정 플 라크 파열 및 경고 없이 혈관을 가리고 하는 사주의 주요 원인 이기도 합니다. 현재 modalities 이미징 안정과 불안정 플 라크 파열을 구별할 수 없습니다. 펩 티 드 amphiphiles micelles (PAMs)로 다양 한 병에 걸린 조직을 구체적으로 바인딩할 moieties를 대상으로 수정할 수 있습니다이 결점을 극복할 수 있다. Monocytes는 monocytes의 큰 축적은 플 라크 파열 경향이 연관 동맥 경화 증의 조기 표식 되도록 표시 되었습니다. 따라서, monocytes 대상 나노 차별 동맥 경화의 다른 단계를 사용할 수 있습니다. 이 위해, 여기, 우리 PAMs monocyte 타겟팅의 준비에 대 한 프로토콜 설명 (monocyte chemoattractant 단백질-1 (MCP-1) PAMs). MCP-1 PAMs 15의 형태로 나노 입자에 온화한 조건에서 합성을 통해 조립 자체는 중립 표면 충전 근처와 직경에서 nm. 생체 외에서 PAMs 생체 발견 했다 및 monocytes에 대 한 높은 바인딩 선호도 했다. 여기에 설명 된 방법을 다른 염증 성 질환 및 동맥 경화에 다양 한 응용 프로그램에 대 한 약속을 보여줍니다.
Introduction
심혈 관 질환 약 17.3 백만 죽음 전세계1와 세계적으로 죽음의 주요한 원인에 남아 있다. 심혈 관계 질환 동맥 경화, 있는 패 동맥, 억제 함으로써 혈액에는 바디2,3의 셀에 산소 흐름을 구축 하는 조건에 의해 크게 기여 하고있다. 동맥 경화 증의 진행 한 염증 반응, 불규칙 한 지질 물질 대사, 및 패 형성, 플 라크 파열과 심근 경색4,5로 이어지는 두껍게 및 동맥의 경화를 포함 한다. 내 피 세포 cytokines와 접착 분자, MCP-1 C-C chemokine 수용 체 (CCR2) monocytes6,,78의 표면에서 발견을 포함 하는 표현. 산화 된 콜레스테롤 플 라크 형성, 지역에서 염증 반응을 증폭 하 고 조직 상해와 불안정 하거나 취약 한 패9, 의 형성의 초기 단계 동안 세포 monocytes 변환 10.
전통적으로, 동맥 경화는 혈관 또는 초음파11,12를 사용 하 여 해부학 적 영상에 의해 luminal 협 착 증을 평가 하 여 평가 됩니다. 그러나, 이러한 방법을 확인할 수 있습니다만 심각한 동맥 벽의 하지 동맥 경화 증의 초기 단계 축소로 초기 패 성장 하면 동맥 크기를 유지 하 여 혈액 흐름 속도12,13, 개장 하는 동맥 14. 따라서, 조 경화 유행 underrepresent. 또한, 비 침 투 적인 이미징 기법 등 단일 광자 방출 단층 촬영, 양전자 방출 단층 촬영 및 자기 공명 영상 최근 그들은 초기 세부 정보를 제공할 수 있는 플 라크 형태를 특성화 하는 데 사용 되었습니다 계산 및 플 라크 특성 그러나, 이러한 형식은 종종 감도, 해상도의 부족에 의해 제한 또는 이미징 패 진행15,16, 훨씬 더 도전 하는 여러 단계에서 만드는 이온화 방사선의 사용을 필요로 17. 특히 동맥 경화 증의 여러 단계에서 플 라크를 식별 것는 영상 전달 시스템 개발에 남아 있다.
나노 입자는 vivo에서 플 라크 타겟팅 및 진단18,19,,2021신흥 플랫폼으로 나타났습니다. 특히, PAMs는 유리한 그들의 화학 다양성 및 moieties, 구성, 크기, 모양 및 표면 기능화22의 다양 한 수용할 수 있습니다. 펩 티 드 amphiphiles (Pa)는 친수성, 펩 티 드 “headgroup”는 일반적으로 지질; 소수 성 꼬리에 연결 구성 이 amphiphilic 구조 자가 조립 기능을 수 여 하 고 입자22,,2324의 표면에 펩 티 드의 multivalent 표시에 대 한 수 있습니다. 펩 티 드 headgroups 폴딩 및 수소 펩 티 드25사이 결합을 통해 입자 모양에 영향을 수 있습니다. Β-시트 상호 작용을 통해 배 펩 티 드 α 나선형 확인 모두 구형 하 고 길쭉한 micelles22,,2324, 를 형성할 수 있다 동안 길쭉한 micelles을 형성 하기 위하여 보였다 25,,2627. 방패는 펩 티 드의 표면 충전 폴 리 에틸렌 글리콜 (PEG) 링커 친수성 펩 티 드와 조직의 순환28, 나노 입자의 가용성을 향상 PAMs의 소수 성 꼬리 사이 놓일 수 있다 29 , 30 , 31. PAMs는 또한 유리 때문에 생체 이며 다양 한 응용 프로그램32,33를가지고 표시 되었습니다. Micelles의 물 용 해도 물에 용 해 되지 않으며 주사34착에 정지 해야 하는 특정 고분자 나노 입자와 같은 나노 기반 시스템 다른 이점을 제공 합니다. 또한, 분해 PAMs 특정 자극에 대 한 응답에서을 제어 세포내 약물 전달35매력적인 후보를 PAMs를 만든다.
CCR2 수용 체에 바인딩 및 대동맥 아치에 축적, PAMs 이전 monocyte 모니터링9대동맥 동맥 경 화성 병 변의 다른 단계를 대상으로 개발 했다. ApoE-/- 생쥐에서 monocyte 누적 패 진행36비례적으로 증가합니다. 또한, 환자 파열 발생 하기 쉬운, 단계의 플 라크 monocytes37의 높은 금액을 포함 발견 했다. 따라서, MCP-1 통합 PAMs 수정은 큰 대상 특이성 및 초기-을 단계의 동맥 경 화성 병 변 사이 감 별 법에 대 한 허용 하기 때문에 유용 합니다. 이러한 개념 증명 연구 또한 PAMs 충분히 안전 하 게 pre-clinically 사용할 수 있으며38renally 삭제를 확인 합니다. Monocytes과 염증은 다른 질병에, MCP-1 PAMs는 롬8,,3940 넘어 다른 질병에서 치료 및 진단 응용 프로그램에 사용 될 가능성이 , 41.
여기, 우리는 입자의 최적의 크기, 표면, 그리고 선택적 monocytes 동맥 경화에서 향상 된 이미징 응용 프로그램을 대상으로 시연 하는 높은 확장성과 자기 조립 MCP-1 PAMs의 제조를 보고 합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
MCP-1 PAMs 친수성 대상 펩 티 드와 소수 성 꼬리는 나노 입자의 자기 조립된 특성을 구성 된 유망 분자 이미징 플랫폼은. 이 monocyte 타겟팅 micelle 간단한 합성 및 (2000)-MCP-1 MCP-1 펩 티 드와 DSPE-못의 정화 단계에 의해 준비 될 수 있습니다. PAMs vivo에서 분자 이미징와 같은 대 한 많은 유익한 특성을가지고 그들의 본질적인 biodegradability, 온화한 조건과 다른 이미징 moieties의 설립을 허용 하는 구조 ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자 남부 캘리포니아 대학, 국가 심 혼, 폐, 혈액 연구소 (NHLBI), R00HL124279, Eli와 Edythe 넓은 혁신 상 수상, 고 L.K. 위 티어 재단 비 암에서 재정 지원을 인정 하 고 싶습니다. 번역 상 연구 상 EJC 부여입니다. 저자 감사는 센터 전자 현미경 및 Microanalysis, NanoBiophysics에 있는 우수의 센터, 분자 특성 분석을 위한 우수의 센터 및 들어가게 이미징 센터에 남부 캘리포니아 대학에 경 음악 설정입니다.
Materials
| 1,2-ethanedithiol | VWR | E0032 | for peptide synthesis |
| 10 mL disposable serological pipets | VWR | 89130-898 | for cell culture |
| 15 mL centrifuge tubes, polypropylene | VWR | 89401-566 | for various applications |
| 2,5-dihydroxybenzoic acid, 99% | Fisher Scientific | AC165200050 | for MALDI |
| 25 mL disposable serological pipets | VWR | 89130-900 | for cell culture |
| 2-Mercaptoethanol, 50 mM | ThermoFisher Scientific | 31350010 | for cell culture |
| 5 mL disposable serological pipets | VWR | 89130-896 | for cell culture |
| 50 mL centrifuge tubes | VWR | 89039-658 | for various applications |
| 75 cm2 culture flask | Fisher Scientific | 13-680-65 | for cell culture |
| 75 mL reaction vessel | Protein Technologies | 3000005 | for peptide synthesis |
| 96-wells cell culture plate | VWR | 40101-346 | for MTS assay |
| Acetonitrile, HPLC grade | Fisher Scientific | A998SK-4 | for HPLC purification |
| Borosilicate glass, 1 dram | VWR | 66011-041 | for PAM synthesis |
| Borosillicate glass pipet, Long tips | VWR | 14673-043 | for various applications |
| Coverslip, 0.16-0.19 mm, 22 x 22 mm | Fisher Scientific | 12-542B | for confocal microscopy |
| Cy5 amine | Abcam | ab146463 | for peptide conjugation |
| Diethyl ether, ACS grade | Fisher Scientific | E138-1 | for peptide precipitation |
| Disposable syringes, 20 mL | Fisher Scientific | 14-817-54 | for HPLC purification |
| Double neubauer ruled hemocytometer | VWR | 63510-13 | for cell counting |
| DSPE-PEG(2000) amine | Avanti | 880128P | for peptide conjugation |
| DSPE-PEG(2000) maleimide | Avanti | 880126P | for peptide conjugation |
| DSPE-PEG(2000)-NHS ester | Nanocs | PG2-DSNS-10K | for conjugation to Cy5 |
| Dulbecco's modified eagle medium-high glucose | Sigma Aldrich | D5796-500ML | for cell culture |
| Fetal bovine serum, qualified, heat inactivated | ThermoFisher Scientific | 10438026 | for cell culture |
| Fmoc-L-Ala-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-A | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-RBF | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Asn(Trt)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-NT | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Cys(Trt)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-CT | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Gln(Trt)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-QT | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Ile-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-I | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Leu-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-L | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Lys(Boc)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-KBC | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Phe-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-F | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Ser(tBu)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-SB | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Thr(tBu)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-TB | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-YB | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Val-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-V | for peptide synthesis |
| Fmoc-Lys(Boc)-wang resin, 100-200 mesh | Novabiochem | 856013 | for peptide synthesis |
| Formic acid, optima LC/MS grade | Fisher Scientific | A117-50 | for HPLC purification |
| Glycerol | VWR | M152-1L | for confocal microscopy |
| Hand tally counter | Fisher Scientific | S90189 | for cell counting |
| Magnetic stir bars, egg-shaped | VWR | 58949-006 | for peptide conjugation |
| Methanol, ACS certified | Fisher Scientific | A412-4 | for PAM synthesis |
| MTS cell proliferation colorimetric assay kit | VWR | 10191-104 | for MTS assay |
| N,N-Dimethylformamide, sequencing grade | Fisher Scientific | BP1160-4 | for peptide synthesis |
| N-Methylmorpholine | Protein Technologies | S-1L-NMM | for peptide synthesis |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | AC416780250 | for fixing cells |
| PBS, pH 7.4 | ThermoFisher Scientific | 10010049 | for various applications |
| Penicillin/streptomycin, 10,000 U/mL | ThermoFisher Scientific | 15140122 | for cell culture |
| Peptide synthesis vessel, 25 mL | Fisher Scientific | CG186011 | for peptide synthesis |
| Phosphotungstic acid | Fisher Scientific | A248-25 | for TEM |
| Piperidine | Spectrum | P1146-2.5LTGL | for peptide synthesis |
| Plain glass microscope slide 75 x 25 mm | Fisher Scientific | 12-550-A3 | for confocal microscopy |
| Reagent reservoirs, sterile | VWR | 95128093 | for cell culture |
| Self-closing tweezer | TedPella | 515 | for TEM |
| TEM support film | TedPella | 01814F | for TEM |
| Trifluoroacetic acid | Fisher Scientific | BP618-500 | for peptide cleavage and HPLC purification |
| Triisopropylsilane | VWR | TCT1533-5ml | for peptide cleavage |
| Trypan blue solution, 0.4% | ThermoFisher Scientific | 15250061 | for cell counting |
| Tweezer, general purpose-serrated | VWR | 231-SA-SE | for confocal microscopy |
| WEHI-274.1 | ATCC | ATCC CRL-1679 | murine monocyte |
| automated benchtop peptide synthesizer | Protein Technologies | PS3 Benchtop Peptide Synthesizer | |
| α- cyano- 4- hydroxycinnamic acid, 99% | Sigma Aldrich | 476870-2G | for MALDI |
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