Detta dokument presenterar en metod som omfattar syntes och karakterisering av monocyt-targeting peptid amphiphile miceller och motsvarande analyser för att testa för biokompatibilitet och micelle förmåga att binda till monocyter.
Åderförkalkning är en stor bidragsgivare till hjärt-kärlsjukdom, den ledande dödsorsaken i världen, vilken fordran 17,3 miljoner liv årligen. Åderförkalkning är också den vanligaste orsaken till plötslig död och hjärtinfarkt, initieras av instabila plack som brista och Täpp blodkärl utan varning. Aktuella imaging villkoren inte kan skilja mellan stabila och instabila plack som brista. Peptid amphiphiles miceller (PAMs) kan övervinna denna nackdel som de kan ändras med olika inriktning beståndsdelarna som binder specifikt till sjuk vävnad. Monocyter har visat sig vara tidiga markörer för ateroskleros, medan stor ackumulation av monocyter är associerad med plack som är benägna att brista. Nanopartiklar som kan rikta monocyter kan därför användas för att diskriminera olika stadier av åderförkalkning. Därför här, beskriver vi ett protokoll för beredning av monocyt-targeting PAMs (monocyt korrektiv protein-1 (MCP-1) PAMs). MCP-1 PAMs monteras själv genom syntes under milda förhållanden för formuläret nanopartiklar 15 nm i diameter med nära neutralt ytladdning. In vitro, PAMs befanns vara biokompatibelt och hade en hög affinitet för monocyter. De metoder som beskrivs häri visar löfte för ett brett spektrum av applikationer i åderförkalkning samt andra inflammatoriska sjukdomar.
Hjärt-och kärlsjukdomar förblir vara de ledande dödsorsakerna globalt med cirka 17,3 miljoner dödsfall i världen1. Hjärt-och kärlsjukdomar tillhandahålls av åderförkalkning, ett tillstånd där plack bygga upp i artärerna, därmed hämmande blod och syre flöde till cellerna i kroppen2,3. Utvecklingen av åderförkalkning innebär förtjockning och åderförkalkning genom en inflammatorisk reaktion, oregelbundna lipidmetabolismen och plack byggs upp, vilket leder till plack bristning och hjärtinfarkt4,5. Endotelceller uttrycker cytokiner och vidhäftning molekylar, som inkluderar MCP-1 som binder till C-C chemokine receptorn (CCR2) finns på ytan av monocyter6,7,8. Oxiderat kolesterol konverterar monocyter till makrofager under den tidiga fasen av plack, vilket förstärker den inflammatoriska reaktionen i regionen och leder till vävnadsskada och bildandet av instabila eller sårbara plack9, 10.
Traditionellt, utvärderas åderförkalkning genom att bedöma luminala stenos av anatomiska imaging använder angiografi eller ultraljud11,12. Dessa metoder kan dock endast avgöra allvarlig förträngning av kärlväggen och inte i tidigt skede av åderförkalkning, eftersom inledande plack tillväxt orsakar arteriell remodeling att upprätthålla artär storlek och blod flödet klassar12,13, 14. Därför underrepresent angiograms åderförkalkning prevalens. Dessutom beräknas noninvasiv avbildningstekniker såsom single photon emission tomography, positron emissions tomografi och magnetisk resonanstomografi har nyligen använts för att karakterisera plack morfologi som de kan ge ursprungliga detaljer och karakterisering av plack. Men dessa modaliteter begränsas ofta av bristen på lyhördhet, rumslig upplösning, eller kräva användning av joniserande strålning, att göra imaging plack progression i olika skeden mycket mer utmanande15,16, 17. En tänkbar leveranssystem som specifikt identifierar plack i olika skeden av åderförkalkning är fortfarande utvecklas.
Nanopartiklar har visat sig vara en framväxande plattform för i vivo plack inriktning och diagnostik18,19,20,21. PAMs är särskilt fördelaktig på grund av deras kemiska mångfald och förmåga att tillgodose en mängd olika beståndsdelarna, kompositioner, storlekar, former och ytan funktionalisering22. Peptid amphiphiles (PAs) består av en hydrofil, peptid ”headgroup” bifogas en hydrofoba svans, som vanligtvis är lipider; Denna amfifila struktur ger själv montering funktioner och möjliggör en multivalenta visning av peptider på ytan av den partikel22,23,24. Den peptid headgroups kan påverka partikel formen genom vikning och vätebindningen mellan peptider25. Peptider som vik genom β-ark interaktion har visat att bilda långsträckt miceller, medan α-spiralformade bekräftelse kan bilda båda sfäriska och långsträckt miceller22,23,24, 25,26,27. Polyetylenglykol (PEG) linkers som skydda surface laddningen av peptiden kan placeras mellan den hydrofila peptiden och hydrofoba svansen på PAMs, förbättra tillgången till nanopartikelportföljen i systemcirkulationen28, 29 , 30 , 31. PAMs är också fördelaktigt eftersom de är biokompatibelt och har visat sig ha ett brett spektrum av applikationer32,33. Bevattnasolubilityen av miceller erbjuder en fördel över andra nanopartikel-baserat system såsom vissa polymera nanopartiklar som inte är lösligt i vatten och måste avbrytas i solubilizers för injektionsvätskor34. Dessutom gör möjligheten att skapa PAMs som isär som svar på en specifik stimuli PAMs en attraktiv kandidat för kontrollerade intracellulära drogen leverans35.
Genom att binda till receptorn CCR2 och ansamlas i aortabågen, utvecklades tidigare PAMs för monocyt inriktning för att övervaka olika stadier av aterosklerotiska lesioner i aorta9. I ApoE– / – möss, monocyt ackumulation ökar proportionellt till plack progression36. Dessutom konstaterades det att patienter med bristning-benägen, sent stadium plack innehåller högre mängder av monocyter37. Ändring av PAMs att införliva MCP-1 är därför användbar eftersom den ger större inriktning specificitet och differentiering mellan tidig – och sent stadium aterosklerotiska lesioner. Dessa proof-of-concept studier också bekräftat att PAMs är tillräckligt säkra för att användas pre-clinically och rensas renalt38. Monocyter och inflammation är kännetecknande för andra sjukdomar, har MCP-1 PAMs potential att användas för terapeutiska och diagnostiska program i andra sjukdomar utöver åderförkalkning8,39,40 , 41.
Häri, rapporterar vi tillverkning av skalbara och själv monterade MCP-1 PAMs som visat partikeln optimal storlek, ytladdning och selektiv inriktning att monocyter för förbättrad bildprogram i åderförkalkning.
MCP-1 PAMs är en lovande molekylär imaging plattform, bestående av en hydrofil inriktning peptid och hydrofoba svans som driver själv monterade beskaffenhet nanopartikelportföljen. Detta monocyt-inriktning micelle kan framställas genom enkel syntes och reningssteg för MCP-1 peptid och DSPE-PEG (2000)-MCP-1. PAMs har många positiva egenskaper för i vivo molekylär imaging som deras självmontering under milda förhållanden, inneboende biologisk nedbrytbarhet och strukturella och kemiska mångfald möjli…
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill erkänna det finansiella stödet från University of Southern California, nationella hjärtat, Lung, och blod Institute (NHLBI), R00HL124279, Eli och Edythe bred Innovation Award och Larsson Whittier stiftelsen icke-Cancer Translational Research Award ges till EJC. Författarna tackar centrum för elektron mikroskopi och mikroanalys, Center of Excellence i NanoBiophysics, Center of Excellence för molekylär karaktärisering och Translational Imaging Center vid University of Southern California för bistånd i instrumental uppställningar.
1,2-ethanedithiol | VWR | E0032 | for peptide synthesis |
10 mL disposable serological pipets | VWR | 89130-898 | for cell culture |
15 mL centrifuge tubes, polypropylene | VWR | 89401-566 | for various applications |
2,5-dihydroxybenzoic acid, 99% | Fisher Scientific | AC165200050 | for MALDI |
25 mL disposable serological pipets | VWR | 89130-900 | for cell culture |
2-Mercaptoethanol, 50 mM | ThermoFisher Scientific | 31350010 | for cell culture |
5 mL disposable serological pipets | VWR | 89130-896 | for cell culture |
50 mL centrifuge tubes | VWR | 89039-658 | for various applications |
75 cm2 culture flask | Fisher Scientific | 13-680-65 | for cell culture |
75 mL reaction vessel | Protein Technologies | 3000005 | for peptide synthesis |
96-wells cell culture plate | VWR | 40101-346 | for MTS assay |
Acetonitrile, HPLC grade | Fisher Scientific | A998SK-4 | for HPLC purification |
Borosilicate glass, 1 dram | VWR | 66011-041 | for PAM synthesis |
Borosillicate glass pipet, Long tips | VWR | 14673-043 | for various applications |
Coverslip, 0.16-0.19 mm, 22 x 22 mm | Fisher Scientific | 12-542B | for confocal microscopy |
Cy5 amine | Abcam | ab146463 | for peptide conjugation |
Diethyl ether, ACS grade | Fisher Scientific | E138-1 | for peptide precipitation |
Disposable syringes, 20 mL | Fisher Scientific | 14-817-54 | for HPLC purification |
Double neubauer ruled hemocytometer | VWR | 63510-13 | for cell counting |
DSPE-PEG(2000) amine | Avanti | 880128P | for peptide conjugation |
DSPE-PEG(2000) maleimide | Avanti | 880126P | for peptide conjugation |
DSPE-PEG(2000)-NHS ester | Nanocs | PG2-DSNS-10K | for conjugation to Cy5 |
Dulbecco's modified eagle medium-high glucose | Sigma Aldrich | D5796-500ML | for cell culture |
Fetal bovine serum, qualified, heat inactivated | ThermoFisher Scientific | 10438026 | for cell culture |
Fmoc-L-Ala-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-A | for peptide synthesis |
Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-RBF | for peptide synthesis |
Fmoc-L-Asn(Trt)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-NT | for peptide synthesis |
Fmoc-L-Cys(Trt)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-CT | for peptide synthesis |
Fmoc-L-Gln(Trt)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-QT | for peptide synthesis |
Fmoc-L-Ile-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-I | for peptide synthesis |
Fmoc-L-Leu-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-L | for peptide synthesis |
Fmoc-L-Lys(Boc)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-KBC | for peptide synthesis |
Fmoc-L-Phe-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-F | for peptide synthesis |
Fmoc-L-Ser(tBu)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-SB | for peptide synthesis |
Fmoc-L-Thr(tBu)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-TB | for peptide synthesis |
Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-YB | for peptide synthesis |
Fmoc-L-Val-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-V | for peptide synthesis |
Fmoc-Lys(Boc)-wang resin, 100-200 mesh | Novabiochem | 856013 | for peptide synthesis |
Formic acid, optima LC/MS grade | Fisher Scientific | A117-50 | for HPLC purification |
Glycerol | VWR | M152-1L | for confocal microscopy |
Hand tally counter | Fisher Scientific | S90189 | for cell counting |
Magnetic stir bars, egg-shaped | VWR | 58949-006 | for peptide conjugation |
Methanol, ACS certified | Fisher Scientific | A412-4 | for PAM synthesis |
MTS cell proliferation colorimetric assay kit | VWR | 10191-104 | for MTS assay |
N,N-Dimethylformamide, sequencing grade | Fisher Scientific | BP1160-4 | for peptide synthesis |
N-Methylmorpholine | Protein Technologies | S-1L-NMM | for peptide synthesis |
Paraformaldehyde | Fisher Scientific | AC416780250 | for fixing cells |
PBS, pH 7.4 | ThermoFisher Scientific | 10010049 | for various applications |
Penicillin/streptomycin, 10,000 U/mL | ThermoFisher Scientific | 15140122 | for cell culture |
Peptide synthesis vessel, 25 mL | Fisher Scientific | CG186011 | for peptide synthesis |
Phosphotungstic acid | Fisher Scientific | A248-25 | for TEM |
Piperidine | Spectrum | P1146-2.5LTGL | for peptide synthesis |
Plain glass microscope slide 75 x 25 mm | Fisher Scientific | 12-550-A3 | for confocal microscopy |
Reagent reservoirs, sterile | VWR | 95128093 | for cell culture |
Self-closing tweezer | TedPella | 515 | for TEM |
TEM support film | TedPella | 01814F | for TEM |
Trifluoroacetic acid | Fisher Scientific | BP618-500 | for peptide cleavage and HPLC purification |
Triisopropylsilane | VWR | TCT1533-5ml | for peptide cleavage |
Trypan blue solution, 0.4% | ThermoFisher Scientific | 15250061 | for cell counting |
Tweezer, general purpose-serrated | VWR | 231-SA-SE | for confocal microscopy |
WEHI-274.1 | ATCC | ATCC CRL-1679 | murine monocyte |
automated benchtop peptide synthesizer | Protein Technologies | PS3 Benchtop Peptide Synthesizer | |
α- cyano- 4- hydroxycinnamic acid, 99% | Sigma Aldrich | 476870-2G | for MALDI |