Syntesen av monocyt-targeting peptid Amphiphile miceller för avbildning av ateroskleros
Summary
Detta dokument presenterar en metod som omfattar syntes och karakterisering av monocyt-targeting peptid amphiphile miceller och motsvarande analyser för att testa för biokompatibilitet och micelle förmåga att binda till monocyter.
Abstract
Åderförkalkning är en stor bidragsgivare till hjärt-kärlsjukdom, den ledande dödsorsaken i världen, vilken fordran 17,3 miljoner liv årligen. Åderförkalkning är också den vanligaste orsaken till plötslig död och hjärtinfarkt, initieras av instabila plack som brista och Täpp blodkärl utan varning. Aktuella imaging villkoren inte kan skilja mellan stabila och instabila plack som brista. Peptid amphiphiles miceller (PAMs) kan övervinna denna nackdel som de kan ändras med olika inriktning beståndsdelarna som binder specifikt till sjuk vävnad. Monocyter har visat sig vara tidiga markörer för ateroskleros, medan stor ackumulation av monocyter är associerad med plack som är benägna att brista. Nanopartiklar som kan rikta monocyter kan därför användas för att diskriminera olika stadier av åderförkalkning. Därför här, beskriver vi ett protokoll för beredning av monocyt-targeting PAMs (monocyt korrektiv protein-1 (MCP-1) PAMs). MCP-1 PAMs monteras själv genom syntes under milda förhållanden för formuläret nanopartiklar 15 nm i diameter med nära neutralt ytladdning. In vitro, PAMs befanns vara biokompatibelt och hade en hög affinitet för monocyter. De metoder som beskrivs häri visar löfte för ett brett spektrum av applikationer i åderförkalkning samt andra inflammatoriska sjukdomar.
Introduction
Hjärt-och kärlsjukdomar förblir vara de ledande dödsorsakerna globalt med cirka 17,3 miljoner dödsfall i världen1. Hjärt-och kärlsjukdomar tillhandahålls av åderförkalkning, ett tillstånd där plack bygga upp i artärerna, därmed hämmande blod och syre flöde till cellerna i kroppen2,3. Utvecklingen av åderförkalkning innebär förtjockning och åderförkalkning genom en inflammatorisk reaktion, oregelbundna lipidmetabolismen och plack byggs upp, vilket leder till plack bristning och hjärtinfarkt4,5. Endotelceller uttrycker cytokiner och vidhäftning molekylar, som inkluderar MCP-1 som binder till C-C chemokine receptorn (CCR2) finns på ytan av monocyter6,7,8. Oxiderat kolesterol konverterar monocyter till makrofager under den tidiga fasen av plack, vilket förstärker den inflammatoriska reaktionen i regionen och leder till vävnadsskada och bildandet av instabila eller sårbara plack9, 10.
Traditionellt, utvärderas åderförkalkning genom att bedöma luminala stenos av anatomiska imaging använder angiografi eller ultraljud11,12. Dessa metoder kan dock endast avgöra allvarlig förträngning av kärlväggen och inte i tidigt skede av åderförkalkning, eftersom inledande plack tillväxt orsakar arteriell remodeling att upprätthålla artär storlek och blod flödet klassar12,13, 14. Därför underrepresent angiograms åderförkalkning prevalens. Dessutom beräknas noninvasiv avbildningstekniker såsom single photon emission tomography, positron emissions tomografi och magnetisk resonanstomografi har nyligen använts för att karakterisera plack morfologi som de kan ge ursprungliga detaljer och karakterisering av plack. Men dessa modaliteter begränsas ofta av bristen på lyhördhet, rumslig upplösning, eller kräva användning av joniserande strålning, att göra imaging plack progression i olika skeden mycket mer utmanande15,16, 17. En tänkbar leveranssystem som specifikt identifierar plack i olika skeden av åderförkalkning är fortfarande utvecklas.
Nanopartiklar har visat sig vara en framväxande plattform för i vivo plack inriktning och diagnostik18,19,20,21. PAMs är särskilt fördelaktig på grund av deras kemiska mångfald och förmåga att tillgodose en mängd olika beståndsdelarna, kompositioner, storlekar, former och ytan funktionalisering22. Peptid amphiphiles (PAs) består av en hydrofil, peptid ”headgroup” bifogas en hydrofoba svans, som vanligtvis är lipider; Denna amfifila struktur ger själv montering funktioner och möjliggör en multivalenta visning av peptider på ytan av den partikel22,23,24. Den peptid headgroups kan påverka partikel formen genom vikning och vätebindningen mellan peptider25. Peptider som vik genom β-ark interaktion har visat att bilda långsträckt miceller, medan α-spiralformade bekräftelse kan bilda båda sfäriska och långsträckt miceller22,23,24, 25,26,27. Polyetylenglykol (PEG) linkers som skydda surface laddningen av peptiden kan placeras mellan den hydrofila peptiden och hydrofoba svansen på PAMs, förbättra tillgången till nanopartikelportföljen i systemcirkulationen28, 29 , 30 , 31. PAMs är också fördelaktigt eftersom de är biokompatibelt och har visat sig ha ett brett spektrum av applikationer32,33. Bevattnasolubilityen av miceller erbjuder en fördel över andra nanopartikel-baserat system såsom vissa polymera nanopartiklar som inte är lösligt i vatten och måste avbrytas i solubilizers för injektionsvätskor34. Dessutom gör möjligheten att skapa PAMs som isär som svar på en specifik stimuli PAMs en attraktiv kandidat för kontrollerade intracellulära drogen leverans35.
Genom att binda till receptorn CCR2 och ansamlas i aortabågen, utvecklades tidigare PAMs för monocyt inriktning för att övervaka olika stadier av aterosklerotiska lesioner i aorta9. I ApoE– / – möss, monocyt ackumulation ökar proportionellt till plack progression36. Dessutom konstaterades det att patienter med bristning-benägen, sent stadium plack innehåller högre mängder av monocyter37. Ändring av PAMs att införliva MCP-1 är därför användbar eftersom den ger större inriktning specificitet och differentiering mellan tidig – och sent stadium aterosklerotiska lesioner. Dessa proof-of-concept studier också bekräftat att PAMs är tillräckligt säkra för att användas pre-clinically och rensas renalt38. Monocyter och inflammation är kännetecknande för andra sjukdomar, har MCP-1 PAMs potential att användas för terapeutiska och diagnostiska program i andra sjukdomar utöver åderförkalkning8,39,40 , 41.
Häri, rapporterar vi tillverkning av skalbara och själv monterade MCP-1 PAMs som visat partikeln optimal storlek, ytladdning och selektiv inriktning att monocyter för förbättrad bildprogram i åderförkalkning.
Protocol
Representative Results
Discussion
MCP-1 PAMs är en lovande molekylär imaging plattform, bestående av en hydrofil inriktning peptid och hydrofoba svans som driver själv monterade beskaffenhet nanopartikelportföljen. Detta monocyt-inriktning micelle kan framställas genom enkel syntes och reningssteg för MCP-1 peptid och DSPE-PEG (2000)-MCP-1. PAMs har många positiva egenskaper för i vivo molekylär imaging som deras självmontering under milda förhållanden, inneboende biologisk nedbrytbarhet och strukturella och kemiska mångfald möjli…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill erkänna det finansiella stödet från University of Southern California, nationella hjärtat, Lung, och blod Institute (NHLBI), R00HL124279, Eli och Edythe bred Innovation Award och Larsson Whittier stiftelsen icke-Cancer Translational Research Award ges till EJC. Författarna tackar centrum för elektron mikroskopi och mikroanalys, Center of Excellence i NanoBiophysics, Center of Excellence för molekylär karaktärisering och Translational Imaging Center vid University of Southern California för bistånd i instrumental uppställningar.
Materials
| 1,2-ethanedithiol | VWR | E0032 | for peptide synthesis |
| 10 mL disposable serological pipets | VWR | 89130-898 | for cell culture |
| 15 mL centrifuge tubes, polypropylene | VWR | 89401-566 | for various applications |
| 2,5-dihydroxybenzoic acid, 99% | Fisher Scientific | AC165200050 | for MALDI |
| 25 mL disposable serological pipets | VWR | 89130-900 | for cell culture |
| 2-Mercaptoethanol, 50 mM | ThermoFisher Scientific | 31350010 | for cell culture |
| 5 mL disposable serological pipets | VWR | 89130-896 | for cell culture |
| 50 mL centrifuge tubes | VWR | 89039-658 | for various applications |
| 75 cm2 culture flask | Fisher Scientific | 13-680-65 | for cell culture |
| 75 mL reaction vessel | Protein Technologies | 3000005 | for peptide synthesis |
| 96-wells cell culture plate | VWR | 40101-346 | for MTS assay |
| Acetonitrile, HPLC grade | Fisher Scientific | A998SK-4 | for HPLC purification |
| Borosilicate glass, 1 dram | VWR | 66011-041 | for PAM synthesis |
| Borosillicate glass pipet, Long tips | VWR | 14673-043 | for various applications |
| Coverslip, 0.16-0.19 mm, 22 x 22 mm | Fisher Scientific | 12-542B | for confocal microscopy |
| Cy5 amine | Abcam | ab146463 | for peptide conjugation |
| Diethyl ether, ACS grade | Fisher Scientific | E138-1 | for peptide precipitation |
| Disposable syringes, 20 mL | Fisher Scientific | 14-817-54 | for HPLC purification |
| Double neubauer ruled hemocytometer | VWR | 63510-13 | for cell counting |
| DSPE-PEG(2000) amine | Avanti | 880128P | for peptide conjugation |
| DSPE-PEG(2000) maleimide | Avanti | 880126P | for peptide conjugation |
| DSPE-PEG(2000)-NHS ester | Nanocs | PG2-DSNS-10K | for conjugation to Cy5 |
| Dulbecco's modified eagle medium-high glucose | Sigma Aldrich | D5796-500ML | for cell culture |
| Fetal bovine serum, qualified, heat inactivated | ThermoFisher Scientific | 10438026 | for cell culture |
| Fmoc-L-Ala-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-A | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-RBF | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Asn(Trt)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-NT | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Cys(Trt)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-CT | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Gln(Trt)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-QT | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Ile-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-I | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Leu-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-L | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Lys(Boc)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-KBC | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Phe-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-F | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Ser(tBu)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-SB | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Thr(tBu)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-TB | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-YB | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Val-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-V | for peptide synthesis |
| Fmoc-Lys(Boc)-wang resin, 100-200 mesh | Novabiochem | 856013 | for peptide synthesis |
| Formic acid, optima LC/MS grade | Fisher Scientific | A117-50 | for HPLC purification |
| Glycerol | VWR | M152-1L | for confocal microscopy |
| Hand tally counter | Fisher Scientific | S90189 | for cell counting |
| Magnetic stir bars, egg-shaped | VWR | 58949-006 | for peptide conjugation |
| Methanol, ACS certified | Fisher Scientific | A412-4 | for PAM synthesis |
| MTS cell proliferation colorimetric assay kit | VWR | 10191-104 | for MTS assay |
| N,N-Dimethylformamide, sequencing grade | Fisher Scientific | BP1160-4 | for peptide synthesis |
| N-Methylmorpholine | Protein Technologies | S-1L-NMM | for peptide synthesis |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | AC416780250 | for fixing cells |
| PBS, pH 7.4 | ThermoFisher Scientific | 10010049 | for various applications |
| Penicillin/streptomycin, 10,000 U/mL | ThermoFisher Scientific | 15140122 | for cell culture |
| Peptide synthesis vessel, 25 mL | Fisher Scientific | CG186011 | for peptide synthesis |
| Phosphotungstic acid | Fisher Scientific | A248-25 | for TEM |
| Piperidine | Spectrum | P1146-2.5LTGL | for peptide synthesis |
| Plain glass microscope slide 75 x 25 mm | Fisher Scientific | 12-550-A3 | for confocal microscopy |
| Reagent reservoirs, sterile | VWR | 95128093 | for cell culture |
| Self-closing tweezer | TedPella | 515 | for TEM |
| TEM support film | TedPella | 01814F | for TEM |
| Trifluoroacetic acid | Fisher Scientific | BP618-500 | for peptide cleavage and HPLC purification |
| Triisopropylsilane | VWR | TCT1533-5ml | for peptide cleavage |
| Trypan blue solution, 0.4% | ThermoFisher Scientific | 15250061 | for cell counting |
| Tweezer, general purpose-serrated | VWR | 231-SA-SE | for confocal microscopy |
| WEHI-274.1 | ATCC | ATCC CRL-1679 | murine monocyte |
| automated benchtop peptide synthesizer | Protein Technologies | PS3 Benchtop Peptide Synthesizer | |
| α- cyano- 4- hydroxycinnamic acid, 99% | Sigma Aldrich | 476870-2G | for MALDI |
References
- Mozaffarian, D., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2016 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 133 (4), e38-e60 (2016).
- Falk, E. Pathogenesis of atherosclerosis. J. Am. Coll. Cardiol. 47 (8, Suppl. C), C7-C12 (2006).
- Rahmani, M., Cruz, R. P., Granville, D. J., McManus, B. M. Allograft Vasculopathy Versus Atherosclerosis. Circ. Res. 99 (8), 801-815 (2006).
- Luis, A. J. Atherosclerosis. Nature. 407 (6801), 233-241 (2000).
- Libby, P., Ridker, P. M., Hansson, G. K. Progress and challenges in translating the biology of atherosclerosis. Nature (London, U. K). 473 (7347), 317-325 (2011).
- Boring, L., Gosling, J., Cleary, M., Charo, I. F. Decreased lesion formation in CCR2-/- mice reveals a role for chemokines in the initiation of atherosclerosis. Nature (London). 394 (6696), 894-897 (1998).
- Szmitko, P. E., et al. New Markers of Inflammation and Endothelial Cell Activation. Circulation. 108 (16), 1917-1923 (2003).
- Deshmane, S. L., Kremlev, S., Amini, S., Sawaya, B. E. Monocyte Chemoattractant Protein-1 (MCP-1): An Overview. J. Interferon Cytokine Res. 29 (6), 313-326 (2009).
- Chung, E. J., et al. Monocyte-Targeting Supramolecular Micellar Assemblies: A Molecular Diagnostic Tool for Atherosclerosis. Adv. Healthcare Mater. 4 (3), 367-376 (2015).
- Chung, E. J. Targeting and therapeutic peptides in nanomedicine for atherosclerosis. Exp Biol Med (Maywood). 241 (9), 891-898 (2016).
- Sanz, J., Fayad, Z. A. Imaging of atherosclerotic cardiovascular disease. Nature (London, U. K.). 451 (7181), 953-957 (2008).
- Tarkin, J. M., et al. Imaging Atherosclerosis. Circ. Res. 118 (4), 750-769 (2016).
- Hennerici, M., Baezner, H., Daffertshofer, M. Ultrasound and arterial wall disease. Cerebrovasc Dis. 17 Suppl 1, 19-33 (2004).
- Nissen, S. E. Application of intravascular ultrasound to characterize coronary artery disease and assess the progression or regression of atherosclerosis. Am J Cardiol. 89 (4A), 24B-31B (2002).
- Khalil, M. M., Tremoleda, J. L., Bayomy, T. B., Gsell, W. Molecular SPECT Imaging: An Overview. Int J Mol Imaging. 2011, 796025 (2011).
- Lerakis, S., et al. Imaging of the vulnerable plaque: noninvasive and invasive techniques. Am J Med Sci. 336 (4), 342-348 (2008).
- Sun, Z. H., Rashmizal, H., Xu, L. Molecular imaging of plaques in coronary arteries with PET and SPECT. J Geriatr Cardiol. 11 (3), 259-273 (2014).
- Godin, B., et al. Emerging applications of nanomedicine for the diagnosis and treatment of cardiovascular diseases. Trends Pharmacol. Sci. 31 (5), 199-205 (2010).
- Branco de Barros, A. L., Tsourkas, A., Saboury, B., Cardoso, V. N., Alavi, A. Emerging role of radiolabeled nanoparticles as an effective diagnostic technique. EJNMMI Res. 2 (1), 31-39 (2012).
- Jayagopal, A., Linton, M. F., Fazio, S., Haselton, F. R. Insights into atherosclerosis using nanotechnology. Curr. Atheroscler. Rep. 12 (3), 209-215 (2010).
- Khodabandehlou, K., Masehi-Lano, J. J., Poon, C., Wang, J., Chung, E. J. Targeting cell adhesion molecules with nanoparticles using in vivo and flow-based in vitro models of atherosclerosis. Exp Biol Med (Maywood). 242 (8), 799-812 (2017).
- Trent, A., Marullo, R., Lin, B., Black, M., Tirrell, M. Structural properties of soluble peptide amphiphile micelles. Soft Matter. 7 (20), 9572-9582 (2011).
- Hartgerink, J. D., Beniash, E., Stupp, S. I. Peptide-amphiphile nanofibers: A versatile scaffold for the preparation of self-assembling materials. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (8), 5133-5138 (2002).
- Missirlis, D., et al. Effect of the Peptide Secondary Structure on the Peptide Amphiphile Supramolecular Structure and Interactions. Langmuir. 27 (10), 6163-6170 (2011).
- Zhong, L., Johnson, W. C. Environment affects amino acid preference for secondary structure. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89 (10), 4462-4465 (1992).
- Shimada, T., Lee, S., Bates, F. S., Hotta, A., Tirrell, M. Wormlike Micelle Formation in Peptide-Lipid Conjugates Driven by Secondary Structure Transformation of the Headgroups. J. Phys. Chem. B. 113 (42), 13711-13714 (2009).
- Missirlis, D., et al. Linker Chemistry Determines Secondary Structure of p5314-29 in Peptide Amphiphile Micelles. Bioconjugate Chem. 21 (3), 465-475 (2010).
- Elbert, D. L., Hubbell, J. A. Surface treatments of polymers for biocompatibility. Annu. Rev. Mater. Sci. 26, 365-394 (1996).
- Xue, Y., O’Mara, M. L., Surawski, P. P. T., Trau, M., Mark, A. E. Effect of Poly(ethylene glycol) (PEG) Spacers on the Conformational Properties of Small Peptides: A Molecular Dynamics Study. Langmuir. 27 (1), 296-303 (2011).
- Canalle, L. A., Loewik, D. W. P. M., van Hest, J. C. M. Polypeptide-polymer bioconjugates. Chem. Soc. Rev. 39 (1), 329-353 (2010).
- Hamley, I. W. PEG-Peptide Conjugates. Biomacromolecules. 15 (5), 1543-1559 (2014).
- Acar, H., et al. Self-assembling peptide-based building blocks in medical applications. Adv. Drug Delivery Rev. , (2016).
- Busseron, E., Ruff, Y., Moulin, E., Giuseppone, N. Supramolecular self-assemblies as functional nanomaterials. Nanoscale. 5 (16), 7098-7140 (2013).
- Barrett, J. C., et al. Modular Peptide Amphiphile Micelles Improving an Antibody-Mediated Immune Response to Group A Streptococcus. ACS Biomater. Sci. Eng. 3 (2), 144-152 (2017).
- Toughrai, S., et al. Reduction-Sensitive Amphiphilic Triblock Copolymers Self-Assemble Into Stimuli-Responsive Micelles for Drug Delivery. Macromol. Biosci. 15 (4), 481-489 (2015).
- Swirski, F. K., et al. Monocyte accumulation in mouse atherogenesis is progressive and proportional to extent of disease. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103 (27), 10340-10345 (2006).
- Kashiwagi, M., et al. Association of monocyte subsets with vulnerability characteristics of coronary plaques as assessed by 64-slice multidetector computed tomography in patients with stable angina pectoris. Atherosclerosis (Amsterdam, Neth). 212 (1), 171-176 (2010).
- Chung, E. J., Tirrell, M. Recent Advances in Targeted, Self-Assembling Nanoparticles to Address Vascular Damage Due to Atherosclerosis. Adv. Healthcare Mater. 4 (16), 2408-2422 (2015).
- Cassetta, L., Pollard, J. W. Cancer immunosurveillance: role of patrolling monocytes. Cell Res. 26 (1), 3-4 (2016).
- Williams, C. B., Yeh, E. S., Soloff, A. C. Tumor-associated macrophages: unwitting accomplices in breast cancer malignancy. NPJ Breast Cancer. 2, (2016).
- Richards, D. M., Hettinger, J., Feuerer, M. Monocytes and Macrophages in Cancer: Development and Functions. Cancer Microenviron. 6 (2), 179-191 (2013).
- Schick, M. J. Effect of temperature on the critical micelle concentration of nonionic detergents. Thermodynamics of micelle formation. J. Phys. Chem. 67 (9), 1796-1799 (1963).
- Marullo, R., Kastantin, M., Drews, L. B., Tirrell, M. Peptide contour length determines equilibrium secondary structure in protein-analogous micelles. Biopolymers. 99 (9), 573-581 (2013).
- Hilbich, C., Kisters-Woike, B., Reed, J., Masters, C. L., Beyreuther, K. Substitutions of hydrophobic amino acids reduce the amyloidogenicity of Alzheimer’s disease βA4 peptides. J. Mol. Biol. 228 (2), 460-473 (1992).
- Trevino, S. R., Scholtz, J. M., Pace, C. N. Amino Acid Contribution to Protein Solubility: Asp, Glu, and Ser Contribute more Favorably than the other Hydrophilic Amino Acids in RNase Sa. J. Mol. Biol. 366 (2), 449-460 (2007).
- Kim, S. W., Shi, Y. Z., Kim, J. Y., Park, K. N., Cheng, J. X. Overcoming the barriers in micellar drug delivery: Loading efficiency, in vivo stability, and micelle-cell interaction. Expert Opin Drug Delivery. 7 (1), 49-62 (2010).
- Rangel-Yagui, C. O., Pessoa, A., Tavares, L. C. Micellar solubilization of drugs. J. Pharm. Pharm. Sci. 8 (2), 147-163 (2005).
- Batrakova, E., et al. Fundamental relationships between the composition of pluronic block copolymers and their hypersensitization effect in MDR cancer cells. Pharm. Res. 16 (9), 1373-1379 (1999).
- Chen, L. J., Lin, S. Y., Huang, C. C. Effect of Hydrophobic Chain Length of Surfactants on Enthalpy-Entropy Compensation of Micellization. J. Phys. Chem. B. 102 (22), 4350-4356 (1998).
