Anwendung der Elektrophysiologie Messung die Aktivität von Electro-neutralen Transporter zu studieren
Summary
Dieses Manuskript beschreibt die Anwendungen der Proton-selektive Elektroden und Patch Methoden spannen, die Aktivität der Proton Transportsysteme zu messen. Diese Methoden überwinden einige Einschränkungen von Techniken, Proton Transportaktivität, z. B. mäßige Empfindlichkeit, Zeitauflösung und unzureichende intrazellulären Milieu Kontrolle zu studieren.
Abstract
Der Transport von Ionen durch Zellmembranen sorgt für die Feinsteuerung der Ionengehalt innerhalb und außerhalb der Zelle, die Zelle Überleben unverzichtbar ist. Diese Transportmechanismen werden durch die Aktivitäten von spezialisierten Transporter-Proteinen vermittelt. Insbesondere pH Dynamik sind fein gesteuert Plasmamembran Proton (H+) Extrusionsanlagen, wie Na+/h+ Wärmetauscher (NHE) Proteinfamilie. Trotz umfangreicher Bemühungen, die Mechanismen NHE Verordnung studieren reicht unser gegenwärtige Verständnis der biophysikalischen und molekularen Eigenschaften der NHE Familie wegen der begrenzten Verfügbarkeit von Methoden, um effektiv NHE Aktivität messen . In diesem Manuskript verwendet wir H+-selektive Elektroden während der gesamten Zelle patch klemmenden Aufnahme um NHE-induzierte H+ Flussmittel zu messen. Wir haben vorgeschlagen, dass dieser Ansatz in der Regel einige Einschränkungen der Methoden zur Messung der NHE Aktivität, z. B. radioaktiven Aufnahme und fluoreszierende Membran Permeants. Messung der NHE Aktivität mit der beschriebenen Methode ermöglicht hohe Empfindlichkeit und Auflösung und eine effizientere Kontrolle der intrazellulären Konzentrationen H+ . H+-selektive Elektroden sind dass Transporter Aktivität eine Ionen-Gradienten in der Nähe an der Zellmembran erstellt. Ein H+-selektiven Elektrode bis zu bewegen und entfernt von der Zellmembran in einer sich wiederholenden, oszillierende Mode zeichnet eine Spannungsdifferenz, die H+ Flux abhängig ist. Während H+-selektive Elektroden werden verwendet, um H+ Flux bewegen aus der Zelle, die Patch-Clamp-Methode in der ganz-Zell Konfiguration dient zur Steuerung der intrazellulären Ionen-Zusammensetzung zu erkennen. Darüber hinaus ermöglicht die Anwendung von riesigen Patch-Clamp-Technik Änderung der intrazellulären Zusammensetzung nicht nur Ionen, sondern auch Lipide. Die Transporter-Aktivität der NHE Isoform 3 (NHE3) wurde durch Phosphoinositides gemessen mit diesem technischen Ansatz, um die molekulare Grundlagen der NHE3-Verordnung zu studieren.
Introduction
Transport von Ionen und gelösten Stoffen über die Plasmamembran ist essentiell für das Überleben der Zellen und damit der Organismen1. Selektive Transport von Ionen und gelösten Stoffen wird durch eine Reihe von spezialisierten Kanal und Transporter-Proteinen erreicht. Mutationen in diesen Proteinen führen oft zu einer Vielzahl von klinischen Bedingungen, Kanal und Transporter Proteine potenzielle Ziele für pharmakologische Behandlung1rendern. Leider ist das Verständnis der Mechanismen, die zugrunde liegenden Kanal und Transporter Funktion und Regulation durch die Ansätze zur Verfügung, um ihre Aktivität2,3,4studieren oft begrenzt.
Insbesondere Transporter können werden grob unterteilt in zwei große Gruppen, je nachdem, ob sie die Zelle transmembranen Potenzial beim Transport von gelösten Stoffen verändern: die Veränderung elektrogenes Ion-Transporter [z. B. Natrium-Phosphat Co-Transporter 2a (NaPi2a), Natrium-Calcium-Austauscher (NCX) usw..] oder die nicht verändernde elektroneutraler Ionen-Transporter [z. B. Natrium-Proton Wärmetauscher (NHE), Natrium-Chlorid-Co-Transporter, NaPi2c, etc..]. Die Aktivitäten der beiden Klassen von Transportern wurden untersucht ausgiebig mit Aufnahme von radioaktiven Isotopen und Membran-permeationsfähigen fluoreszierenden Farbstoffen2. Beide Ansätze schätzen die Tätigkeit der Transporter durch die Messung der Masse Konzentrationsänderungen von speziellen zytoplasmatischen Ionen, und beide Methoden haben Einschränkungen, z. B. mäßige Empfindlichkeit und Zeitauflösung und unzureichende Kontrolle über die intrazelluläre Milieu. In der Tat, die Aktivität von vielen Transportern ist abhängig von der zytoplasmatischen Konzentration der Ionen (z. B. NHE3, NCX) durchgeführten, und Veränderungen in diesen Ionen-Konzentrationen werden voraussichtlich eine wichtige Rolle bei der Regulierung der Transporter Aktivität2 , 3 , 5. präzise Messung dieser regulative Mechanismen beschränkt sich mit klassischen Methoden.
Um diese Einschränkungen zu überwinden, sind Patch-Clamp-Methoden verwendet, um den Transporter Aktivität2,6zu studieren. Insbesondere erlaubt die selbst verweisende ionenselektive Elektroden (ISEs)7,8 in Kombination mit dem Patch Spannsystem vor kurzem die Messung von elektroneutraler Transporter Aktivität3,4 , 5. ISEs sind dass Transporter Aktivität eine Ionen-Gradienten in der Nähe an der Zellmembran erstellt. Ein ISE bewegt sich auf und Weg von der Zellmembran in eine sich wiederholende, zeichnet oszillierende Mode eine Spannungsdifferenz (µV). Spannungsdifferenzen können in Ionen-Fluss Werte mit einer Kalibrierungsmethode, die erste Gesetz des Fick’schen Diffusion2,9gilt umgewandelt werden. Während ISEs verwendet werden zu erkennen, der Fluß der Ionen, die Bewegung von Zellen, Patch-Clamp-Methode in beide ganz-Zelle oder Inside-out-Konfigurationen wird verwendet, um die Membran Potenzial und intrazellulären Ionen-Zusammensetzung zu kontrollieren. Darüber hinaus ermöglicht die Anwendung der riesigen Patch-Clamp-Technik Änderung der intrazellulären Zusammensetzung nicht nur Ionen, sondern auch Lipide und Proteine3,5.
Zusammenfassend lässt sich sagen die Vielseitigkeit der Patch-Clamp-Methode im Vergleich zu, dass andere Methoden zu studieren Transporter Aktivität hat Patch Klemmung geeignet, die allgemeinen Einschränkungen dieser anderen Methoden zu überwinden. Die Kombination von verweisen auf sich selbst ISEs und Patch-Clamp-Technik bietet die einzigartige Möglichkeit, die Aktivität von elektroneutraler Transporter in einem streng kontrollierten experimentellen Umfeld messen und Roman biophysikalische und molekularen entdecken Eigenschaften der Zellmembran transportieren3,4,5. Dieser Ansatz hat erfolgreich eingesetzt, um die Aktivität der NHE zu studieren. Die Säugetier-NHE Proteinfamilie katalysiert die elektroneutraler net Austausch von extrazellulären Natrium (Na+) für intrazelluläre Protonen (H+)10,11 unter Verwendung einer nach innen Na+ Steigung. Bei Säugetieren umfasst die NHE Proteinfamilie 11 verwandte Proteine (NHE1-9 und NHA1-2) und eine Sperma-spezifische NHE10,12,13.
NHEs (SLC9a Familie) sind ubiquitär in den meisten lebenden Organismen aus einfachen Prokaryoten zu höheren Eukaryoten gefunden und engagieren sich in einer Vielzahl von lebenswichtige Zelle Funktionen10,11, einschließlich die Zelle Salzgehalt Verteidigung im controlling Prokaryoten, Aufrechterhaltung des Säure-Basen-Homöostase und Zelle Volumen und reguliert die Aufnahme von Salz und Wasser in verschiedenen spezialisierten Epithelien10,12,14,15. Die biologische Schlüsselrollen NHEs und die Bedeutung ihrer Funktionen wurden durch mehrere Studien festgelegt; jedoch haben einige Studien die biophysikalischen und molekulare Eigenschaften von Säugetieren NHEs Wegen methodischer Einschränkungen4untersucht. Vor kurzem hat die Anwendung von verweisen auf sich selbst ISEs während der gesamten Zelle Patch Klemmung neuartigen molekulare Mechanismen der NHE Isoformen von Änderungen in den intrazellulären Konzentrationen von Ionen, Proteine und Phospholipide3reguliert ergeben, 4.
Insbesondere das Protokoll zur Verfügung gestellt in diesem Manuskript beschreibt die Methoden und Ansätze zur Erforschung der Aktivität und Regulierung der NHE Isoform 3 (NHE3), einer der Hauptakteure bei der Aufnahme von Na+, Cl–, HCO3– und Flüssigkeit in der Bürste Grenze Membran Nieren- und Darm Epithelien14,16. Neue Einblicke in die Unterschiede in der Empfindlichkeit der NHE3 Aktivität, intrazelluläre Phosphoinositides (Phosphatidylinositide 4,5-Bisphosphate [PI (4,5) P2] und Phosphatidylinositide 3,4,5-Triphosphat [PI(3,4,5]P3]) wird berichtet. Zelle-Transport-Proteine, wie Kanäle und Transporter, Phosphoinositides17geregelt sind, und NHE3 bindet direkt PI (4,5) P2 und P3 PI (3,4,5)18. Basierend auf der aktuellen Literatur, könnte entweder Phosphoinositide relevant für die physiologische und pathophysiologische Regulierung des NHE35,18,19. Unsere Befunde stützen separate Rollen für PI (4,5) P2 und P3 PI (3,4,5) bei der Regulierung der NHE3 Aktivität. Diese Unterscheidung war aufgrund der Anwendung der ISE-Techniken in Kombination mit ganzen Zelle Patch Clamp Aufnahme möglich. Diese Technik ermöglicht auch Kontrolle der Phosphoinositide zellulären Inhalte über die intrazelluläre Perfusion der verschiedenen Phosphoinositides während der Messung der NHE3 Tätigkeit.
Protocol
Representative Results
Discussion
Trotz der wichtigen Funktionen von Transportern sind die Methoden zur Verfügung, um ihre Tätigkeit zu studieren ineffektiv und unzureichend. Eine Einschränkung besteht darin, dass die verfügbaren Methoden Ionenbewegung vermittelt durch Transporter Aktivität ohne Rücksicht auf Schwankungen der intrazellulären Ionen-Zusammensetzung während das Experiment4messen. Die vorgestellte Methode sorgt für präzise Steuerung der extrazellulären und intrazellulären Ionen-Kompositionen und bietet ein…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren möchten danke Eric Fishback (Des Moines University, Des Moines, Iowa, USA) für seine Unterstützung bei der Aufnahme und Bearbeitung der Videos. Die PS120 Fibroblasten-ähnliche Zellen stabil mit dem Ausdruck NHE3-wt oder NHE3-YRK wurden freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Dr. Mark Donowitz (Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, MD, USA).
Materials
| Patch clamp Amplifier | Molecular Devices | ||
| Dual Channel Differential Electrometer (HiZ-223) | Warner Instruments | 64-1650 | |
| Differential Amplifier (DP-301) | Warner Instruments | 64-0044 | |
| Patch Clamp Software Based on MatLab | MatLab with acquisition toolbox | The capmeter software is recommended | |
| ThermoClamp-1 Temperature Control System | AutoMate Scientific | 03-11-LL | In-line heater |
| Single-Channel Temperature Controller (TC-324C) | Warner Instruments | 64-2400 | |
| Single-Barrel Standard Borosilicate Glass Tubing | World Precision Instruments | 1B120F-3 | Used for ion selective electrodes |
| Micropipette Storage Jar | World Precision Instruments | E212 | |
| Bis(dimethylamino)dimethylsilane | Sigma-Aldrich | 14755-100ML | |
| Carbon tetrachloride | Sigma-Aldrich | 319961-500ML | |
| Hydrogen ionophore I – cocktail B | Sigma-Aldrich | 95293 | |
| Thin Wall Borosilicate Tubing | Sutter Instrument | B200-156-15 | Used for patch clamp pipette |
| Soft glass (Corning 8161 Patch Glass) | Warner Instruments | 64-0815 | |
| Silica Capillary Tubing (150um OD/75um ID) | Molex (Polymicro Technologies) | 106815-0018 | Used for intra-pipette perfusion system |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Potassium aspartate | Sigma-Aldrich | A6558 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M4880 | |
| Mg-ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| PIPES | Sigma-Aldrich | P6757 | |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| Apyrase | Sigma-Aldrich | A6535 | |
| Phosphatidylinositol(4,5) bisphosphate diC8 | Echelon Biosciences | P-4508 | |
| Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate diC8 | Echelon Biosciences | P-3908 | |
References
- Rives, M. L., Javitch, J. A., Wickenden, A. D. Potentiating SLC transporter activity: Emerging drug discovery opportunities. Biochem Pharmacol. , (2017).
- Kang, T. M., Markin, V. S., Hilgemann, D. W. Ion fluxes in giant excised cardiac membrane patches detected and quantified with ion-selective microelectrodes. J Gen Physiol. 121 (4), 325-347 (2003).
- Babich, V., Vadnagara, K., Di Sole, F. The biophysical and molecular basis of intracellular pH sensing by Na+/H+ exchanger-3. FASEB J. 27 (11), 4646-4658 (2013).
- Fuster, D., Moe, O. W., Hilgemann, D. W. Steady-state function of the ubiquitous mammalian Na/H exchanger (NHE1) in relation to dimer coupling models with 2Na/2H stoichiometry. J Gen Physiol. 132 (4), 465-480 (2008).
- Fuster, D., Moe, O. W., Hilgemann, D. W. Lipid- and mechanosensitivities of sodium/hydrogen exchangers analyzed by electrical methods. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (28), 10482-10487 (2004).
- Forster, I. C., Virkki, L., Bossi, E., Murer, H., Biber, J. Electrogenic kinetics of a mammalian intestinal type IIb Na(+)/P(i) cotransporter. J Membr Biol. 212 (3), 177-190 (2006).
- Smith, P. J., Trimarchi, J. Noninvasive measurement of hydrogen and potassium ion flux from single cells and epithelial structures. Am J Physiol Cell Physiol. 280 (1), C1-C11 (2001).
- Parker, M. D., Musa-Aziz, R., Boron, W. F. The use of extracellular, ion-selective microelectrodes to study the function of heterologously expressed transporters in Xenopus oocytes. Am J Physiol Cell Physiol. 296 (5), C1243 (2009).
- Smith, P. J. S., Sanger, R. H., Messerli, M. A., Michael, A. C., Borland, L. M. . Electrochemical Methods for Neuroscience. , 373-406 (2007).
- Orlowski, J., Grinstein, S. Diversity of the mammalian sodium/proton exchanger SLC9 gene family. Pflugers Arch. 447 (5), 549-565 (2004).
- Brett, C. L., Donowitz, M., Rao, R. Evolutionary origins of eukaryotic sodium/proton exchangers. Am J Physiol Cell Physiol. 288 (2), C223-C239 (2005).
- Bobulescu, I. A., Di Sole, F., Moe, O. W. Na+/H+ exchangers: physiology and link to hypertension and organ ischemia. Curr Opin Nephrol Hypertens. 14 (5), 485-494 (2005).
- Donowitz, M., Ming Tse, C., Fuster, D. SLC9/NHE gene family, a plasma membrane and organellar family of Na(+)/H(+) exchangers. Mol Aspects Med. 34 (2-3), 236-251 (2013).
- Zachos, N. C., Tse, M., Donowitz, M. Molecular physiology of intestinal Na+/H+ exchange. Annu Rev Physiol. 67, 411-443 (2005).
- Girardi, A. C., Di Sole, F. Deciphering the mechanisms of the Na+/H+ exchanger-3 regulation in organ dysfunction. Am J Physiol Cell Physiol. 302 (11), C1569-C1587 (2012).
- Bobulescu, I. A., Moe, O. W. Na+/H+ exchangers in renal regulation of acid-base balance. Semin Nephrol. 26 (5), 334-344 (2006).
- Hilgemann, D. W., Feng, S., Nasuhoglu, C. The complex and intriguing lives of PIP2 with ion channels and transporters. Sci STKE. (111), re19 (2001).
- Mohan, S., et al. NHE3 activity is dependent on direct phosphoinositide binding at the N terminus of its intracellular cytosolic region. J Biol Chem. 285 (45), 34566-34578 (2010).
- Alexander, R. T., et al. Membrane surface charge dictates the structure and function of the epithelial Na+/H+ exchanger. EMBO J. 30 (4), 679-691 (2011).
- Wang, T. M., Hilgemann, D. W. Ca-dependent nonsecretory vesicle fusion in a secretory cell. J Gen Physiol. 132 (1), 51-65 (2008).
- Hilgemann, D. W., Sakmann, B., Neher, E. . Single-Channel Recording. , 307-328 (1995).
- Hilgemann, D. W., Lu, C. C. Giant membrane patches: improvements and applications. Methods Enzymol. 293, 267-280 (1998).
- Matsuoka, S., Takeuchi, A., Okada, Y. . Patch Clamp Techniques. , 207-218 (2012).
- Pouyssegur, J., Sardet, C., Franchi, A., L’Allemain, G., Paris, S. A specific mutation abolishing Na+/H+ antiport activity in hamster fibroblasts precludes growth at neutral and acidic pH. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (15), 4833-4837 (1984).
- Voipio, J., Pasternack, M., MacLeod, K., Ogden, D. . Microelectrode Techniques – The Plymouth Workshop Handbook. , 275-316 (1994).
