Applicazione di misura di elettrofisiologia di studiare l'attività dei trasportatori di Electro-neutro
Summary
Questo manoscritto descrive le applicazioni di elettrodi selettivi protone e patch metodi di bloccaggio per misurare l’attività dei sistemi di trasporto di protoni. Questi metodi di superare alcuni limiti delle tecniche comunemente usate per studiare l’attività di trasporto di protoni, come moderata sensibilità, risoluzione temporale e controllo insufficiente milieu intracellulare.
Abstract
Il trasporto di ioni attraverso le membrane cellulari assicura il controllo preciso del contenuto di ioni all’interno e all’esterno della cellula che è indispensabile per la sopravvivenza delle cellule. Questi meccanismi di trasporto sono mediati dalle attività delle proteine di trasporto specializzate. In particolare, dinamiche di pH sono finemente controllati da sistemi di estrusione del protone (H+) della membrana plasmatica, come Na+/h+ famiglia di proteine dello scambiatore (NHE). Nonostante notevoli sforzi per studiare i meccanismi alla base di regolamento NHE, nostra attuale comprensione delle proprietà biofisiche e molecolare della famiglia NHE è inadeguata a causa della limitata disponibilità di metodi per misurare efficacemente l’attività NHE . In questo manoscritto, abbiamo usato H+-elettrodi selettivi durante intero-cellula patch bloccaggio registrazione per misurare il flusso indotto da NHE H+ . Abbiamo proposto questo approccio per superare alcuni limiti di tipicamente utilizzato metodi per misurare l’attività NHE, quali l’assorbimento radioattivo e membrana fluorescente permeants. La misurazione dell’attività NHE utilizzando il metodo descritto consente ad alta sensibilità e risoluzione temporale e più efficiente controllo delle concentrazioni intracellulari di H+ . H+-elettrodi selettivi si basano sul fatto che il trasportatore attività crea un gradiente di ioni nella prossimità vicina alla membrana cellulare. Un H+-elettrodo selettivo in movimento fino a e distanza dalla membrana cellulare in modo ripetitivo, oscillatorio registra una differenza di tensione che dipende dal flusso di H+ . Mentre H+-elettrodi selettivi sono utilizzati per rilevare il flusso di H+ in movimento fuori dalla cella, il metodo di patch clamp nella configurazione di cellule intere è utilizzato per controllare la composizione intracellulare dello ione. Inoltre, applicazione della tecnica gigante patch clamp consente la modifica della composizione intracellulare di non solo gli ioni, ma anche i lipidi. L’attività di trasportatore di NHE isoforma 3 (NHE3) è stata misurata usando questo approccio tecnico per studiare la base molecolare del regolamento NHE3 fosfoinositidi.
Introduction
Trasporto di ioni e soluti attraverso la membrana plasmatica è essenziale per la sopravvivenza delle cellule e, quindi, di organismi1. Trasporto selettivo di ioni e soluti avviene mediante una matrice di canale specializzato e proteine di trasporto. Le mutazioni in queste proteine provocano spesso una varietà di condizioni cliniche, canale e transporter proteine potenziali bersagli per trattamento farmacologico1di rendering. Purtroppo, la comprensione dei meccanismi alla base funzione canale e transporter e regolamento è spesso limitata dagli approcci disponibili per studiare le loro attività2,3,4.
In particolare, trasportatori possono essere approssimativamente suddivisi in due grandi gruppi a seconda se essi alterano il potenziale transmembrana della cellula durante il trasporto di soluti: i trasportatori dello ione elettrogeniche alterando [ad es., sodio-fosfato co-trasportatore 2a (NaPi2a), scambiatore sodio-calcio (NCX), ecc.] o i trasportatori di ioni elettricamente neutro non alterano [ad es., lo scambiatore sodio-protone (NHE), co-trasportatore sodio-cloruro, NaPi2c, ecc.]. Le attività di entrambe le classi dei trasportatori sono state studiate estesamente utilizzando l’assorbimento degli isotopi radioattivi e coloranti fluorescenti membrana-permeante2. Entrambi gli approcci stimano l’attività dei trasportatori misurando i cambiamenti della concentrazione di massa di ioni specifici citoplasmatici, ed entrambi i metodi hanno dei limiti, come moderata sensibilità e risoluzione temporale e controllo inadeguato di intracellulare milieu. Infatti, l’attività di molti trasportatori è dipenda sulla concentrazione citoplasmatica degli ioni trasportati (ad es., NHE3, NCX), e cambiamenti in queste concentrazioni di ioni sono chiamati a svolgere un ruolo significativo nella regolazione di attività di trasportatore2 , 3 , 5. misurazione precisa di questi meccanismi regolativi è limitato tramite metodi classici.
Per superare queste limitazioni, patch clamp metodi vengono utilizzati per studiare l’attività di trasportatore2,6. In particolare, l’autoreferenziale elettrodi iono-selettivi (ISE)7,8 , combinato con la patch sistema di bloccaggio ha recentemente permesso la misurazione di elettricamente neutro trasportatore attività3,4 , 5. ISEs si basano sul fatto che il trasportatore attività crea un gradiente di ioni nella prossimità vicina alla membrana cellulare. Un ISE salendo a e dalla membrana delle cellule in un ripetitivo, oscillatorio moda registra una differenza di tensione (µV). Differenze di tensione possono essere convertite in valori di flusso dello ione utilizzando un metodo di calibrazione che si applica prima legge di Fick di diffusione2,9. Mentre ISEs sono usati per rilevare il flusso di ioni in movimento su cellule, il metodo di morsetto di patch in entrambi cellule intere o configurazioni di dentro-fuori è usato per controllare la composizione di ioni intracellulari e potenziali di membrana. Inoltre, l’applicazione della tecnica gigante patch clamp consente la modifica della composizione intracellulare di non solo gli ioni, ma anche lipidi e proteine3,5.
In sintesi, la versatilità del metodo patch clamp confrontato con quello di altri metodi per lo studio trasportatore attività ha fatto patch di bloccaggio adatto per superare i limiti comuni di questi altri metodi. La combinazione di autoreferenziali ISEs e tecniche di patch clamp offre la possibilità di misurare l’attività dei trasportatori elettricamente neutro in un ambiente sperimentale controllato e scoprire romanzo molecolare e biofisica Proprietà della membrana cellulare trasporto3,4,5. Questo approccio è stato utilizzato con successo per studiare l’attività della NHE. La famiglia di proteina mammifera NHE catalizza lo scambio netto di elettricamente neutro di sodio extracellulare (Na+) per intracellulare del protone (H+)10,11 utilizzando una pendenza verso l’interno di Na+ . Nei mammiferi, la famiglia di proteine NHE comprende 11 proteine correlate (NHE1-9 e NHA1-2) e un sperma specifiche NHE10,12,13.
Giuseppe (famiglia SLC9a) sono trovati ubiquistmente nella maggior parte dei organismi viventi da semplici procarioti a eucarioti superiori e sono coinvolti in una varietà di cellula vitale funzioni10,11, tra cui il controllo la difesa di salinità delle cellule in procarioti, mantenere il volume delle cellule e l’omeostasi acido-base e che regolano l’assorbimento di acqua e sale in vari epiteli specializzati10,12,14,15. I ruoli biologici chiave di Giuseppe e il significato delle loro funzioni sono stati determinati attraverso diversi studi; Tuttavia, pochi studi hanno studiato le proprietà biofisiche e molecolare di Giuseppe mammiferi a causa di limiti metodologici4. Recentemente, l’applicazione di autoreferenziali ISEs durante il serraggio della intero-cellula patch ha rivelato nuovi meccanismi molecolari delle isoforme NHE regolata da cambiamenti nelle concentrazioni intracellulari di ioni, proteine e fosfolipidi3, 4.
In particolare, il protocollo fornito in questo manoscritto descrive i metodi e approcci per lo studio delle attività e il regolamento di NHE isoforma 3 (NHE3), un attore importante nell’assorbimento di Na+, Cl–, HCO3– e fluido nella spazzola della membrana di confine di epiteli renale ed intestinale14,16. Nuovo approfondimento differenze nella sensibilità di NHE3 attività intracellulare fosfoinositidi (phosphatidylinositide 4,5-bisfosfato [PI (4,5) P2] e phosphatidylinositide 3, 4,5-trifosfato [PI(3,4,5]P3]) è segnalato. Proteine di trasporto delle cellule, quali canali e trasportatori, sono regolati dai fosfoinositidi17e NHE3 si lega direttamente sia PI (4,5) P2 e P3 di PI (3, 4,5)18. Sulla base della letteratura corrente, entrambi phosphoinositide potrebbe essere rilevante per la regolazione fisiologica o patofisiologica di NHE35,18,19. I nostri risultati sostengono ruoli separati per PI (4,5) P2 e P3 di PI (3, 4,5) nella regolazione dell’attività NHE3. Questa distinzione fu possibile grazie all’applicazione di tecniche ISE in combinazione con registrazione di cellule intere patch clamp. Questa tecnica permette anche il controllo del contenuto cellulare phosphoinositide tramite la perfusione intracellulare di fosfoinositidi differenti durante la misurazione dell’attività NHE3.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nonostante le funzioni cruciali dei trasportatori, i metodi disponibili per studiare le loro attività sono inefficace e inadeguata. Una limitazione è che i metodi disponibili misurano il movimento di ioni mediata da trasportatore attività senza considerare le fluttuazioni nella composizione di ioni intracellulari durante l’esperimento4. Il metodo proposto garantisce un controllo preciso delle composizioni di ioni extracellulari ed intracellulari e offre un potente strumento per la modifica di i…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori vorrei ringraziare Eric Fishback (Università di Des Moines, Des Moines, Iowa, USA) per la sua assistenza con riprese e montaggio video. Il PS120 fibroblasto-come le cellule che esprimono stabilmente NHE3-wt o NHE3-YRK sono state gentilmente concesse dal Dr. Mark Donowitz (Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, MD, USA).
Materials
| Patch clamp Amplifier | Molecular Devices | ||
| Dual Channel Differential Electrometer (HiZ-223) | Warner Instruments | 64-1650 | |
| Differential Amplifier (DP-301) | Warner Instruments | 64-0044 | |
| Patch Clamp Software Based on MatLab | MatLab with acquisition toolbox | The capmeter software is recommended | |
| ThermoClamp-1 Temperature Control System | AutoMate Scientific | 03-11-LL | In-line heater |
| Single-Channel Temperature Controller (TC-324C) | Warner Instruments | 64-2400 | |
| Single-Barrel Standard Borosilicate Glass Tubing | World Precision Instruments | 1B120F-3 | Used for ion selective electrodes |
| Micropipette Storage Jar | World Precision Instruments | E212 | |
| Bis(dimethylamino)dimethylsilane | Sigma-Aldrich | 14755-100ML | |
| Carbon tetrachloride | Sigma-Aldrich | 319961-500ML | |
| Hydrogen ionophore I – cocktail B | Sigma-Aldrich | 95293 | |
| Thin Wall Borosilicate Tubing | Sutter Instrument | B200-156-15 | Used for patch clamp pipette |
| Soft glass (Corning 8161 Patch Glass) | Warner Instruments | 64-0815 | |
| Silica Capillary Tubing (150um OD/75um ID) | Molex (Polymicro Technologies) | 106815-0018 | Used for intra-pipette perfusion system |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Potassium aspartate | Sigma-Aldrich | A6558 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M4880 | |
| Mg-ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| PIPES | Sigma-Aldrich | P6757 | |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| Apyrase | Sigma-Aldrich | A6535 | |
| Phosphatidylinositol(4,5) bisphosphate diC8 | Echelon Biosciences | P-4508 | |
| Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate diC8 | Echelon Biosciences | P-3908 | |
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