Anvendelse av elektrofysiologi mål å studere aktiviteten til elektro-nøytral transportører
Summary
Dette manuskriptet beskriver programmer proton-selektiv elektroder og patch clamping metoder å måle aktiviteten til proton transportsystemer. Disse metodene overvinne noen begrensninger teknikker brukes vanligvis til å studere proton transport aktivitet, for eksempel middels følsomhet, tid oppløsning og utilstrekkelig intracellulær miljøet kontroll.
Abstract
Transport av ioner gjennom cellemembraner sikrer god kontroll av ion innhold innenfor og utenfor cellen som er uunnværlig for cellen overlevelse. Disse transportmekanismer er formidlet av aktivitetene til spesialiserte transportkanaler. Spesielt pH dynamics er fint kontrollert av plasma membranen proton (H+) ekstrudering systemer, slik som Na+h+ exchanger (NHE) protein familie. Til tross for omfattende innsats for å studere mekanismene bak NHE regulering, er vår nåværende forståelse av egenskapene Biofysiske og molekylære NHE familien utilstrekkelig på grunn av den begrensede tilgjengeligheten av metoder for å effektivt måle NHE aktivitet . I dette manuskriptet vi brukte H+-selektiv elektroder under hele celle patch klem opptak for å måle NHE-indusert H+ flux. Vi foreslått denne tilnærmingen å overvinne noen begrensninger av vanligvis anvendt metoder for å måle NHE aktivitet, for eksempel radioaktivt opptak og fluorescerende membran permeants. Måling av NHE aktivitet med metoden beskrevet kan høy følsomhet og tid oppløsning og mer effektiv kontroll for intracellulær H+ . H+-selektiv elektrodene er basert på det faktum at transporter aktivitet skaper en ion gradert i nærheten cellemembranen. En H+-selektiv elektrode flytte til og fra cellemembranen i en repeterende, oscillasjon mote registrerer en spenning forskjell som er avhengig av H+ flux. Mens H+-selektiv elektrodene brukes til å oppdage H+ flux flytte ut av cellen, patch klemme metoden i hele celle konfigurasjonen brukes til å kontrollere intracellulær ion sammensetningen. Videre lar programmet av gigantiske oppdateringen klemme teknikken endring av intracellulær sammensetningen av ikke bare ioner, men også lipider. Transporter aktiviteten til NHE isoformen 3 (NHE3) ble målt ved hjelp av denne tekniske tilnærmingen for å studere molekylære grunnlaget for NHE3 regulering av phosphoinositides.
Introduction
Ioner og solutes over plasma membranen er avgjørende for overlevelsen av celler, og dermed organismer1. Selektiv transport av ioner og solutes oppnås ved en rekke spesialiserte kanal og transporter proteiner. Mutasjoner i disse proteinene ofte resultere i en rekke klinisk betingelser gjengivelse kanal og transporter proteiner potensielle mål for farmakologisk behandling1. Dessverre, forstå mekanismene bak kanalen og transporter og regulering er ofte begrenset av tilnærminger tilgjengelig å studere deres aktivitet2,3,4.
Spesielt transportører omtrent sub deles inn i to store grupper avhengig av om de endre cellen transmembrane potensial under transport av solutes: endre electrogenic ion transportører [f.eks natrium-fosfat co transporter 2a (NaPi2a), natrium-kalsium exchanger (NCX), etc.] eller ikke-altering electroneutral ion transportører [f.eks natrium-proton exchanger (NHE), natriumklorid co transporter, NaPi2c, etc.]. Aktivitetene til begge typer transportører har blitt studert grundig med opptak isotopene og fluorescerende membran-permeant fargestoffer2. Begge tilnærminger anslå aktiviteten til transportører ved å måle endringer i bulk konsentrasjonen av bestemte cytoplasmatiske ioner, og begge metodene har begrensninger, som moderat følsomhet og tid oppløsning og manglende kontroll over den intracellulær miljøet. Faktisk, mange transportører aktiviteten er avhengig av cytoplasmatiske konsentrasjonen av de gjennomført ionene (f.eks NHE3, NCX), og endringer i disse ion konsentrasjoner er forventet å spille en betydelig rolle i å regulere transporter aktivitet2 , 3 , 5. nøyaktig måling av disse regulative mekanismene er begrenset ved hjelp av klassisk metoder.
For å overvinne disse begrensningene, brukes oppdateringen klemme metoder å studere transporter aktivitet2,6. Spesielt har de selvrefererende ion-selektive elektroder (ISEs)7,8 kombinert med oppdateringen clamping systemet nylig tillatt måling av electroneutral transporter aktivitet3,4 , 5. ISEs er basert på det faktum at transporter aktivitet skaper en ion gradert i nærheten cellemembranen. En ISE flytte opp til og fra cellemembranen i en repeterende, registrerer oscillasjon mote en spenning forskjell (µV). Spenning forskjeller kan konverteres til ion flux verdier med en kalibrering metode som gjelder Ficks første lov av diffusjon2,9. Mens ISEs brukes å oppdage fluks av ioner flytting ut av celler, patch klemme metoden i både hele celler eller innsiden ut konfigurasjoner brukes til å kontrollere membran potensial og intracellulær ion sammensetningen. Videre lar programmet av gigantiske oppdateringen klemme teknikken endring av intracellulær sammensetningen av ikke bare ioner, men også lipider og proteiner3,5.
I sammendraget sammenlignet allsidighet av metoden oppdateringen klemme med at andre metoder for å studere transporter aktivitet har gjort oppdateringen clamping egnet til å overvinne vanlige begrensningene til disse andre metodene. Kombinasjonen av selvrefererende ISEs og patch klemme teknikker tilbyr en enestående mulighet til å måle aktiviteten til electroneutral transportører i et strengt kontrollert eksperimentelle miljø og oppdage romanen Biofysiske og molekylære Egenskaper for celle membran transport3,4,5. Denne tilnærmingen har blitt brukt til å studere aktiviteten til NHE. Pattedyr NHE protein familien gir electroneutral netto utveksling av ekstracellulære natrium (Na+) for intracellulær proton (H+)10,11 utnytte en innover Na+ -gradering. I pattedyr inkluderer NHE protein familien 11 relaterte proteiner (NHE1-9 og NHA1-2) og en sæd-spesifikke NHE10,12,13.
NHEs (SLC9a familien) finnes overalt i de fleste levende organismer fra simple prokaryoter til høyere eukaryoter og er involvert i en rekke viktige celle funksjoner10,11, herunder kontrollere celle saltholdighet Forsvaret i prokaryoter, opprettholde syre-base homeostase og celle volum og regulere absorpsjon av salt og vann i ulike spesialiserte epithelia10,12,14,15. Biologiske nøkkelroller av NHEs og betydningen av deres funksjoner er funnet gjennom flere studier; imidlertid har få studier undersøkt Biofysiske og molekylære egenskapene for pattedyr NHEs på grunn av metodologiske begrensningene4. Nylig har anvendelsen av selvrefererende ISEs under hele celle oppdateringen clamping avslørt romanen molekylære mekanismer av NHE isoformene regulert av endringer i intracellulær konsentrasjonen av ioner, proteiner og fosfolipider3, 4.
Spesielt protokollen i dette manuskriptet skisserer metoder og tilnærminger for å studere aktiviteten og regulering av NHE isoformen 3 (NHE3), en stor aktør i absorpsjonen av Na+, Cl–, HCO3– og væske i den Brush-grensen membran nyre og intestinal epithelia14,16. Ny innsikt i forskjeller på følsomheten av NHE3 aktivitet intracellulær phosphoinositides (phosphatidylinositide 4,5-bisphosphate [PI (4,5) P2] og phosphatidylinositide 3,4,5-trifosfat [PI(3,4,5]P3]) rapporteres. Celle transport proteiner, som kanaler og transportører, er regulert av phosphoinositides17, og NHE3 binder direkte både PI (4,5) P2 og PI (3,4,5) P318. Basert på gjeldende litteratur, kunne enten phosphoinositide være relevant for fysiologiske eller patofysiologiske regulering av NHE35,18,19. Våre funn støtte egne roller for PI (4,5) P2 og PI (3,4,5) P3 i regulering av NHE3 aktivitet. Dette skillet ble mulig bruk av ISE teknikker i kombinasjon med hele celle oppdateringen klemme opptak. Denne teknikken kan også kontroll over phosphoinositide mobilnettet innholdet via intracellulær perfusjon av ulike phosphoinositides under måling av NHE3 aktivitet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Til tross for de avgjørende funksjonene av transportører er metodene tilgjengelig å studere deres aktivitet ineffektive og utilstrekkelig. En begrensning er at de tilgjengelige metodene måle ion bevegelse formidlet av transporter aktivitet uten å vurdere svingninger i intracellulær ion komposisjon under eksperimentet4. Presentert metoden sikrer presis kontroll over ekstracellulære og intracellulære ion komposisjoner og tilbyr et kraftig verktøy for å endre intracellulær ion, protein og …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gjerne takke Eric Fishback (Des Moines University, Des Moines, Iowa, USA) for hans hjelp med skyting og redigering av video. PS120 fibroblast-lignende cellene stabilt uttrykke NHE3-wt eller NHE3-YRK fotograferingen av Dr. Mark Donowitz (Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, MD, USA).
Materials
| Patch clamp Amplifier | Molecular Devices | ||
| Dual Channel Differential Electrometer (HiZ-223) | Warner Instruments | 64-1650 | |
| Differential Amplifier (DP-301) | Warner Instruments | 64-0044 | |
| Patch Clamp Software Based on MatLab | MatLab with acquisition toolbox | The capmeter software is recommended | |
| ThermoClamp-1 Temperature Control System | AutoMate Scientific | 03-11-LL | In-line heater |
| Single-Channel Temperature Controller (TC-324C) | Warner Instruments | 64-2400 | |
| Single-Barrel Standard Borosilicate Glass Tubing | World Precision Instruments | 1B120F-3 | Used for ion selective electrodes |
| Micropipette Storage Jar | World Precision Instruments | E212 | |
| Bis(dimethylamino)dimethylsilane | Sigma-Aldrich | 14755-100ML | |
| Carbon tetrachloride | Sigma-Aldrich | 319961-500ML | |
| Hydrogen ionophore I – cocktail B | Sigma-Aldrich | 95293 | |
| Thin Wall Borosilicate Tubing | Sutter Instrument | B200-156-15 | Used for patch clamp pipette |
| Soft glass (Corning 8161 Patch Glass) | Warner Instruments | 64-0815 | |
| Silica Capillary Tubing (150um OD/75um ID) | Molex (Polymicro Technologies) | 106815-0018 | Used for intra-pipette perfusion system |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Potassium aspartate | Sigma-Aldrich | A6558 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M4880 | |
| Mg-ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| PIPES | Sigma-Aldrich | P6757 | |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| Apyrase | Sigma-Aldrich | A6535 | |
| Phosphatidylinositol(4,5) bisphosphate diC8 | Echelon Biosciences | P-4508 | |
| Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate diC8 | Echelon Biosciences | P-3908 | |
References
- Rives, M. L., Javitch, J. A., Wickenden, A. D. Potentiating SLC transporter activity: Emerging drug discovery opportunities. Biochem Pharmacol. , (2017).
- Kang, T. M., Markin, V. S., Hilgemann, D. W. Ion fluxes in giant excised cardiac membrane patches detected and quantified with ion-selective microelectrodes. J Gen Physiol. 121 (4), 325-347 (2003).
- Babich, V., Vadnagara, K., Di Sole, F. The biophysical and molecular basis of intracellular pH sensing by Na+/H+ exchanger-3. FASEB J. 27 (11), 4646-4658 (2013).
- Fuster, D., Moe, O. W., Hilgemann, D. W. Steady-state function of the ubiquitous mammalian Na/H exchanger (NHE1) in relation to dimer coupling models with 2Na/2H stoichiometry. J Gen Physiol. 132 (4), 465-480 (2008).
- Fuster, D., Moe, O. W., Hilgemann, D. W. Lipid- and mechanosensitivities of sodium/hydrogen exchangers analyzed by electrical methods. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (28), 10482-10487 (2004).
- Forster, I. C., Virkki, L., Bossi, E., Murer, H., Biber, J. Electrogenic kinetics of a mammalian intestinal type IIb Na(+)/P(i) cotransporter. J Membr Biol. 212 (3), 177-190 (2006).
- Smith, P. J., Trimarchi, J. Noninvasive measurement of hydrogen and potassium ion flux from single cells and epithelial structures. Am J Physiol Cell Physiol. 280 (1), C1-C11 (2001).
- Parker, M. D., Musa-Aziz, R., Boron, W. F. The use of extracellular, ion-selective microelectrodes to study the function of heterologously expressed transporters in Xenopus oocytes. Am J Physiol Cell Physiol. 296 (5), C1243 (2009).
- Smith, P. J. S., Sanger, R. H., Messerli, M. A., Michael, A. C., Borland, L. M. . Electrochemical Methods for Neuroscience. , 373-406 (2007).
- Orlowski, J., Grinstein, S. Diversity of the mammalian sodium/proton exchanger SLC9 gene family. Pflugers Arch. 447 (5), 549-565 (2004).
- Brett, C. L., Donowitz, M., Rao, R. Evolutionary origins of eukaryotic sodium/proton exchangers. Am J Physiol Cell Physiol. 288 (2), C223-C239 (2005).
- Bobulescu, I. A., Di Sole, F., Moe, O. W. Na+/H+ exchangers: physiology and link to hypertension and organ ischemia. Curr Opin Nephrol Hypertens. 14 (5), 485-494 (2005).
- Donowitz, M., Ming Tse, C., Fuster, D. SLC9/NHE gene family, a plasma membrane and organellar family of Na(+)/H(+) exchangers. Mol Aspects Med. 34 (2-3), 236-251 (2013).
- Zachos, N. C., Tse, M., Donowitz, M. Molecular physiology of intestinal Na+/H+ exchange. Annu Rev Physiol. 67, 411-443 (2005).
- Girardi, A. C., Di Sole, F. Deciphering the mechanisms of the Na+/H+ exchanger-3 regulation in organ dysfunction. Am J Physiol Cell Physiol. 302 (11), C1569-C1587 (2012).
- Bobulescu, I. A., Moe, O. W. Na+/H+ exchangers in renal regulation of acid-base balance. Semin Nephrol. 26 (5), 334-344 (2006).
- Hilgemann, D. W., Feng, S., Nasuhoglu, C. The complex and intriguing lives of PIP2 with ion channels and transporters. Sci STKE. (111), re19 (2001).
- Mohan, S., et al. NHE3 activity is dependent on direct phosphoinositide binding at the N terminus of its intracellular cytosolic region. J Biol Chem. 285 (45), 34566-34578 (2010).
- Alexander, R. T., et al. Membrane surface charge dictates the structure and function of the epithelial Na+/H+ exchanger. EMBO J. 30 (4), 679-691 (2011).
- Wang, T. M., Hilgemann, D. W. Ca-dependent nonsecretory vesicle fusion in a secretory cell. J Gen Physiol. 132 (1), 51-65 (2008).
- Hilgemann, D. W., Sakmann, B., Neher, E. . Single-Channel Recording. , 307-328 (1995).
- Hilgemann, D. W., Lu, C. C. Giant membrane patches: improvements and applications. Methods Enzymol. 293, 267-280 (1998).
- Matsuoka, S., Takeuchi, A., Okada, Y. . Patch Clamp Techniques. , 207-218 (2012).
- Pouyssegur, J., Sardet, C., Franchi, A., L’Allemain, G., Paris, S. A specific mutation abolishing Na+/H+ antiport activity in hamster fibroblasts precludes growth at neutral and acidic pH. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (15), 4833-4837 (1984).
- Voipio, J., Pasternack, M., MacLeod, K., Ogden, D. . Microelectrode Techniques – The Plymouth Workshop Handbook. , 275-316 (1994).
