Aplicación de medición de electrofisiología para estudiar la actividad de transportadores de Electro-neutro
Summary
Este manuscrito describe las aplicaciones de electrodos selectivos de protón y parche sujeción métodos para medir la actividad de los sistemas de transporte de protones. Estos métodos superaran algunas limitaciones de las técnicas comúnmente utilizadas para estudiar la actividad de transporte de protones, como sensibilidad moderada, resolución de tiempo y control insuficiente medio intracelular.
Abstract
El transporte de iones a través de las membranas celulares asegura el control fino del contenido de iones dentro y fuera de la célula que es indispensable para la supervivencia de la célula. Estos mecanismos de transporte están mediados por la actividad de proteínas transportadoras especializadas. Específicamente, pH dinámica es finalmente controlado por sistemas de extrusión de protones (H+) membrana plasmática, como el Na+/+ h familia de proteínas de intercambiador (NHE). A pesar de grandes esfuerzos para estudiar los mecanismos que subyacen la regulación NHE, nuestra comprensión actual de las propiedades biofísicas y moleculares de la familia NHE es insuficiente debido a la limitada disponibilidad de métodos para medir con eficacia la actividad NHE . En este manuscrito, utilizamos H+-electrodos selectivos durante celulares parche sujeción grabación para medir flujo inducido NHE H+ . Nos propone este enfoque para superar algunas limitaciones de típicamente utiliza métodos para medir la actividad NHE, tales como la absorción radiactiva y fluorescente membrana permeants. Medición de la actividad NHE usando el método descrito permite la alta sensibilidad y resolución de tiempo y un control más eficiente de la concentración intracelular de H+ . H+-electrodos selectivos están basado en el hecho de que actividad transportista crea un gradiente de iones en proximidad cercana a la membrana celular. Un H+-Electrodo selectivo moviendo hasta y lejos de la membrana celular de manera repetitiva, oscilatoria registra una diferencia de voltaje que depende del flujo de H+ . Mientras que H+-electrodos selectivos se utilizan para detectar flujo H+ móvil fuera de la célula, el método de patch clamp en la configuración de célula entera se utiliza para controlar la composición de iones intracelulares. Por otra parte, aplicación de la técnica de abrazadera del remiendo gigante permite la modificación de la composición intracelular de iones, pero también lípidos. La actividad de transportador de las isoformas NHE 3 (NHE3) se midió usando este enfoque técnico para estudiar la base molecular de la regulación NHE3 de fosfoinosítidos.
Introduction
Transporte de iones y solutos a través de la membrana plasmática es esencial para la supervivencia de las células y, por ende, de los organismos1. Transporte selectivo de iones y solutos se logra mediante una serie de canales especializados y proteínas transportadoras. Las mutaciones en estas proteínas a menudo resultan en una variedad de condiciones clínicas, haciendo canales y transportador de proteínas potenciales dianas para el tratamiento farmacológico1. Desgraciadamente, entender los mecanismos subyacentes a canal y transportador de la función y la regulación está limitada a menudo por los métodos disponibles para estudiar su actividad2,3,4.
Específicamente, transportadores pueden aproximadamente sub-dividirse en dos grandes grupos dependiendo de si altera el potencial de transmembrana de la célula durante el transporte de solutos: los transportadores de iones electrógenos alterar [p. ej., sodio fosfato transportador de co 2a (NaPi2a), intercambiador de sodio-calcio (NCX), etcetera.] o los transportadores de iones no alterar electroneutral [p. ej., intercambiador de sodio-proton (NHE), cloruro de sodio Co transportador, NaPi2c, etcetera.]. Las actividades de ambas clases de transportadores han sido estudiadas extensivamente mediante captación de isótopos radiactivos y membrana-permeant fluorescente tintes2. Ambos enfoques estiman la actividad de los transportadores por la medición de cambios en la concentración mayor de iones citoplasmáticas específicas, y ambos métodos tienen limitaciones, como la sensibilidad moderada y resolución de tiempo y control inadecuado de la intracelular medio. De hecho, la actividad de muchos transportadores es dependiente en la concentración citoplasmática de iones llevados (por ejemplo, NHE3, NCX) y cambios en las concentraciones de estos iones se esperan jugar un papel importante en la regulación de la actividad de transporter2 , 3 , 5. medición precisa de estos mecanismos de regulación se limita mediante métodos clásicos.
Para superar estas limitaciones, métodos de abrazadera del remiendo se utilizan para estudiar la actividad de transportador2,6. En concreto, el auto hace referencia a electrodos ion-selectivos (ISEs)7,8 combinado con el parche de sistema de sujeción ha permitido recientemente la medición de electroneutral transportador actividad3,4 , 5. ISEs están basado en el hecho de que actividad transportista crea un gradiente de iones en proximidad cercana a la membrana celular. Un ISE mover para arriba y lejos de la membrana de la célula en un repetitivo, manera oscilatoria registra una diferencia de voltaje (MV). Diferencias de voltaje se pueden convertir en valores del flujo de iones utilizando un método de calibración que se aplica la primera ley de Fick de la difusión2,9. Mientras que ISEs se utilizan detectar el flujo de iones hacia fuera de las células, el método de la abrazadera de parche en ambos celulares o configuraciones de adentro hacia afuera se utiliza para controlar la composición de iones intracelulares y potencial de membrana. Por otra parte, la aplicación de la técnica de abrazadera del remiendo gigante permite la modificación de la composición intracelular de iones, sino también los lípidos y las proteínas3,5.
En Resumen, la versatilidad del método de la abrazadera de parche en comparación con que otros métodos para el estudio de actividad transportador ha hecho parche de sujeción adecuado para superar las limitaciones comunes de estos métodos. La combinación de auto referencia ISEs y técnicas de patch clamp ofrece la posibilidad única para medir la actividad de transportadores electroneutral en un entorno experimental bien controlado y a descubrir la novela biofísico y molecular propiedades de la membrana celular de transporte3,4,5. Este enfoque se ha utilizado con éxito para estudiar la actividad de la NHE. La familia de proteínas de mamíferos NHE cataliza el intercambio neto de electroneutral de sodio extracelular (Na+) para protón intracelular (H+)10,11 utilizando un gradiente de Na+ hacia adentro. En los mamíferos, la familia de proteínas NHE incluye 11 relacionados con proteínas (NHE1-9 NHA1-2) y un espermatozoide específico NHE10,12,13.
NHEs (SLC9a familia) se encuentran ubicuo en los organismos vivos más de simples procariotas a eucariotas superiores y están implicados en una variedad de células vitales funciones10,11, incluyendo control de la defensa de la salinidad de la célula en procariotas, mantener volumen de célula y homeostasis acido-base y regulación de la absorción de sal y agua en diversos epitelios especializados10,12,14,15. Las funciones biológicas clave de NHEs y la importancia de sus funciones han sido determinadas a través de varios estudios; sin embargo, pocos estudios han investigado las propiedades biofísicas y moleculares de mamíferos NHEs debido a limitaciones metodológicas4. Recientemente, la aplicación de la auto referencia ISEs en parche de célula entera sujeción ha revelado nuevos mecanismos moleculares de las isoformas NHE regulada por cambios en las concentraciones intracelulares de iones, proteínas y fosfolípidos3, 4.
Específicamente, el protocolo en este manuscrito describe los métodos y enfoques para el estudio de la actividad y la regulación de las isoformas NHE 3 (NHE3), un jugador importante en la absorción de Na+, Cl–, HCO3– y líquido en el membrana de frontera de cepillo del epitelio intestinal y renal14,16. Nueva visión sobre las diferencias en la sensibilidad de la actividad de NHE3 a fosfoinosítidos intracelular (phosphatidylinositide 4, 5-bifosfato [PI (4,5) P2] y phosphatidylinositide 3,4,5-trifosfato [PI(3,4,5]P3]) se divulga. Proteínas de transporte de la célula, tales como canales y transportadores, están reguladas por phosphoinositides17y NHE3 enlaza directamente PI (4,5) P2 y PI (3,4,5) P318. Basado en la literatura actual, ya sea Fosfoinositol podría ser relevante para la regulación fisiológica o fisiopatológica del NHE35,18,19. Nuestros resultados apoyan funciones separadas para PI (4,5) P2 y P3 de PI (3,4,5) en la regulación de la actividad de NHE3. Esta distinción fue posible debido a la aplicación de técnicas ISE en combinación con la grabación de abrazadera de parche de células completas. Esta técnica también permite el control del contenido celular de Fosfoinositol mediante la perfusión intracelular de fosfoinosítidos diferentes durante la medición de la actividad de NHE3.
Protocol
Representative Results
Discussion
A pesar de las funciones cruciales de los transportadores, los métodos disponibles para el estudio de su actividad son ineficaces e inadecuados. Una limitación es que los métodos disponibles medir el movimiento de iones, mediada por la actividad de transportista sin tener en cuenta las fluctuaciones en la composición de iones intracelulares durante el experimento4. El método presentado garantiza un control preciso de las composiciones de ion extracelular e intracelular y ofrece una poderosa h…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer a Eric Fishback (Universidad de Des Moines, Des Moines, Iowa, Estados Unidos) por su asistencia con rodaje y edición del video. PS120 fibroblasto-como las células expresando estable NHE3 wt o NHE3 YRK fueron proporcionadas amablemente por el Dr. Mark Donowitz (Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, MD, USA).
Materials
| Patch clamp Amplifier | Molecular Devices | ||
| Dual Channel Differential Electrometer (HiZ-223) | Warner Instruments | 64-1650 | |
| Differential Amplifier (DP-301) | Warner Instruments | 64-0044 | |
| Patch Clamp Software Based on MatLab | MatLab with acquisition toolbox | The capmeter software is recommended | |
| ThermoClamp-1 Temperature Control System | AutoMate Scientific | 03-11-LL | In-line heater |
| Single-Channel Temperature Controller (TC-324C) | Warner Instruments | 64-2400 | |
| Single-Barrel Standard Borosilicate Glass Tubing | World Precision Instruments | 1B120F-3 | Used for ion selective electrodes |
| Micropipette Storage Jar | World Precision Instruments | E212 | |
| Bis(dimethylamino)dimethylsilane | Sigma-Aldrich | 14755-100ML | |
| Carbon tetrachloride | Sigma-Aldrich | 319961-500ML | |
| Hydrogen ionophore I – cocktail B | Sigma-Aldrich | 95293 | |
| Thin Wall Borosilicate Tubing | Sutter Instrument | B200-156-15 | Used for patch clamp pipette |
| Soft glass (Corning 8161 Patch Glass) | Warner Instruments | 64-0815 | |
| Silica Capillary Tubing (150um OD/75um ID) | Molex (Polymicro Technologies) | 106815-0018 | Used for intra-pipette perfusion system |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Potassium aspartate | Sigma-Aldrich | A6558 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M4880 | |
| Mg-ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| PIPES | Sigma-Aldrich | P6757 | |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| Apyrase | Sigma-Aldrich | A6535 | |
| Phosphatidylinositol(4,5) bisphosphate diC8 | Echelon Biosciences | P-4508 | |
| Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate diC8 | Echelon Biosciences | P-3908 | |
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