Tillämpningen av elektrofysiologi mätning av att studera aktiviteten av Electro-Neutral transportörer
Summary
Detta manuskript beskriver tillämpningar av proton-elektroder och patch fastspänning metoder att mäta aktiviteten av proton transportsystem. Dessa metoder övervinna vissa begränsningar av tekniker som ofta används för att studera proton transport aktivitet, till exempel måttlig känslighet, tidsupplösning och otillräcklig intracellulära milieu kontroll.
Abstract
Transport av joner genom cellmembranen garanterar fina kontroll av ion innehåll inom och utanför cellen som är oumbärlig för cellöverlevnad. Dessa transportmekanismer medieras av verksamheten i specialiserade transporter proteiner. Specifikt, pH dynamics styrs fint av plasmamembranet proton (H+) extrudering system, såsom Na+/h+ värmeväxlare (NHE) protein familj. Trots omfattande insatser för att studera mekanismerna bakom NHE förordning, är vår nuvarande förståelse av familjen NHE biofysiska och molekylära egenskaper otillräcklig på grund av den begränsade tillgången av metoder för att effektivt mäta NHE aktivitet . I detta manuskript, använde vi H+-elektroder under hela-cell patch fastspänning inspelning för att mäta NHE-inducerad H+ flux. Vi föreslog att denna metod att övervinna vissa begränsningar normalt används metoder för att mäta NHE aktivitet, såsom radioaktivt upptag och fluorescerande membran permeanters. Mätning av NHE verksamheten med den beskrivna metoden möjliggör hög känslighet och tidsupplösning och effektivare kontroll av intracellulära H+ koncentrationer. H+-elektroder är baserad på det faktum att transportören aktiviteten skapar en ion lutning i nära närhet till cellmembranet. En H+-selektiv elektrod flyttar upp till och bort från cellmembranet i ett repetitivt, oscillerande mode registrerar en spänningsskillnad som är beroende av H+ flux. Medan H+-elektroder används för att upptäcka H+ flux flytta ut ur cellen, den patch clamp-metoden i hela-cell konfigurationen används för att styra intracellulär jonen sammansättningen. Dessutom tillåter tillämpningen av giant patch clamp tekniken modifiering av intracellulära sammansättning inte bara joner men också lipider. Transportören aktiviteten av NHE isoform 3 (NHE3) mättes med hjälp av denna tekniska metod för att studera den molekylära basen för NHE3 förordning av phosphoinositides.
Introduction
Transport av joner och koncentrationsfördelningen över plasmamembranet är avgörande för överlevnaden av celler och därmed organismer1. Selektiv transport av joner och koncentrationsfördelningen uppnås genom en rad specialiserade kanal och transportören proteiner. Mutationer i dessa proteiner resulterar ofta i en mängd olika kliniska tillstånd, rendering kanal och transporter proteiner potentiella mål för farmakologisk behandling1. Tyvärr, förstå mekanismerna bakom kanal och transportör funktion och förordning begränsas ofta av metoderna som är tillgängliga att studera deras aktivitet2,3,4.
Specifikt, transportörer kan grovt delas in i två stora grupper beroende på huruvida de ändra cellen transmembrana potential under transport av lösta ämnen: ändra electrogenic ion transportörerna [t.ex. -natriumfosfat kotransportör 2a (NaPi2a), natrium-kalcium exchanger (NCX), etc.] eller icke-förändra electroneutral ion transportörerna [t.ex. natrium-proton exchanger (NHE), natriumklorid kotransportör, NaPi2c, etc.]. Verksamheten i båda klasserna av transportörer har studerats flitigt använda upptag av radioaktiva isotoper och fluorescerande membran-diffusionskoefficient färgämnen2. Båda metoderna uppskatta aktiviteten av transportörer genom att mäta förändringar i bulk koncentrationen av specifik Cytoplasmatisk joner, och båda metoderna har begränsningar, såsom måttlig känslighet och tidsupplösning och otillräcklig kontroll av den intracellulära miljö. Faktiskt, aktiviteten av många transportörer är beroende av den cytoplasmiska koncentrationen av transporteras joner (t.ex. NHE3, NCX), och förändringar i dessa jonkoncentrationer förväntas spela en betydande roll i regleringen transporter aktivitet2 , 3 , 5. exakt mätning av dessa förordningar mekanismer är begränsad använder klassiska metoder.
För att övervinna dessa begränsningar, metoderna patch clamp att studera den transportör aktivitet2,6. Specifikt, har självrefererande jonselektiva elektroder (PFD)7,8 i kombination med plåstret fastspänningssystem nyligen tillåtits mätning av electroneutral transportör aktivitet3,4 , 5. ISEs är baserad på det faktum att transportören aktiviteten skapar en ion lutning i nära närhet till cellmembranet. En ISE att flytta till och från cellmembranet i ett repetitivt, registrerar oscillerande mode en spänningsskillnad (µV). Spänning skillnader kan omvandlas till ion flux värden använder en kalibreringsmetod som gäller ficks första lag av diffusion2,9. Medan ISEs används att upptäcka flödet av joner flyttar av celler, den patch clamp-metoden i både hela-cell eller inifrån och ut konfigurationer används för att styra membranet potential och intracellulär jonen sammansättningen. Dessutom tillåter tillämpningen av giant patch clamp tekniken modifiering av intracellulära sammansättning inte bara joner men också lipider och proteiner3,5.
Sammanfattningsvis jämfört mångsidigheten hos den patch clamp metoden med att transportören aktivitet av andra metoder för att studera har gjort patch fastspänning lämplig att övervinna de vanliga begränsningarna av dessa andra metoder. Kombinationen av självrefererande ISEs och patch clamp tekniker erbjuder den unika möjligheten att mäta aktiviteten av electroneutral transportörer i en väl kontrollerad experimentell miljö och upptäcka roman biofysiska och molekylär egenskaper hos cellmembranet transport3,4,5. Detta tillvägagångssätt har använts framgångsrikt att studera aktiviteten av NHE. Proteinfamiljen från däggdjur NHE katalyserar electroneutral netto utbyte av extracellulära natrium (Na+) för intracellulära proton (H+)10,11 utnyttja en inåtgående Na+ lutning. Hos däggdjur innehåller familjen NHE protein 11 relaterade proteiner (NHE1-9 och NHA1-2) och en sperma-specifika NHE10,12,13.
NHEs (SLC9a familj) finns ubiquitously i de flesta levande organismer från enkla prokaryoter till högre Eukaryoter och medverkar i en mängd viktiga cell funktioner10,11, inklusive kontroll av cell salthalt försvar i prokaryoter, syra-bas homeostas och cell volymen behålls och reglerar upptaget av salt och vatten i olika specialiserade epitel10,12,14,15. NHEs viktiga biologiska roller och betydelsen av deras funktioner har bestämts genom flera studier; några studier har dock undersökt däggdjur NHEs biofysiska och molekylära egenskaper på grund av metodologiska begränsningar4. Nyligen, tillämpningen av självrefererande ISEs under hela-cell patch fastspänning har avslöjat nya molekylära mekanismer av NHE isoformer regleras av förändringar i den intracellulära koncentrationen av joner, proteiner och fosfolipider3, 4.
Specifikt, det protokoll som anges i detta manuskript beskriver de metoder och tillvägagångssätt för att studera aktivitet och reglering av NHE isoform 3 (NHE3), en stor aktör i absorptionen av Na+, Cl–, HCO3– och vätska i den pensel gränserna membran av njur- och intestinal epitel14,16. Nya insikter i skillnaderna i känslighet för NHE3 verksamhet till intracellulära phosphoinositides (phosphatidylinositide 4,5-bisphosphate [PI (4,5) P2] och phosphatidylinositide 3,4,5-trifosfat [PI(3,4,5]P3]) rapporteras. Cell transportproteiner, såsom kanaler och transportörer, regleras av phosphoinositides17och NHE3 binder direkt både PI (4,5) P2 och P3 PI (3,4,5)18. Baserat på den aktuella litteraturen, kan antingen fosfoinositid vara relevanta för fysiologiska eller patofysiologiska regleringen av NHE35,18,19. Våra fynd stöder separata roller för PI (4,5) P2 och PI (3,4,5) P3 i regleringen av NHE3 aktivitet. Denna åtskillnad var möjligt på grund av tillämpningen av ISE tekniker i kombination med hela-cell patch clamp inspelning. Denna teknik möjliggör även styrning av fosfoinositid cellulära innehållet via intracellulära perfusionen i olika phosphoinositides under mätningen av NHE3 aktivitet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Trots den avgörande funktionen transportörer är metoderna som finns att studera deras verksamhet ineffektiva och otillräckliga. En begränsning är att de tillgängliga metoderna mäter ion rörelse medieras av transportören aktivitet utan att beakta fluktuationer i intracellulär jonen sammansättning under de experiment4. Den presenterade metoden garanterar exakt kontroll av extracellulära och intracellulära ion kompositioner och erbjuder ett kraftfullt verktyg för att ändra intracellul…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka Eric Fishback (Des Moines universitet, Des Moines, Iowa, USA) för hans hjälp med fotografering och redigering videon. PS120 fibroblast-liknande cellerna stabilt uttrycker NHE3-wt eller NHE3-YRK var vänligen tillhandahållen av Dr. Mark Donowitz (Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, MD, USA).
Materials
| Patch clamp Amplifier | Molecular Devices | ||
| Dual Channel Differential Electrometer (HiZ-223) | Warner Instruments | 64-1650 | |
| Differential Amplifier (DP-301) | Warner Instruments | 64-0044 | |
| Patch Clamp Software Based on MatLab | MatLab with acquisition toolbox | The capmeter software is recommended | |
| ThermoClamp-1 Temperature Control System | AutoMate Scientific | 03-11-LL | In-line heater |
| Single-Channel Temperature Controller (TC-324C) | Warner Instruments | 64-2400 | |
| Single-Barrel Standard Borosilicate Glass Tubing | World Precision Instruments | 1B120F-3 | Used for ion selective electrodes |
| Micropipette Storage Jar | World Precision Instruments | E212 | |
| Bis(dimethylamino)dimethylsilane | Sigma-Aldrich | 14755-100ML | |
| Carbon tetrachloride | Sigma-Aldrich | 319961-500ML | |
| Hydrogen ionophore I – cocktail B | Sigma-Aldrich | 95293 | |
| Thin Wall Borosilicate Tubing | Sutter Instrument | B200-156-15 | Used for patch clamp pipette |
| Soft glass (Corning 8161 Patch Glass) | Warner Instruments | 64-0815 | |
| Silica Capillary Tubing (150um OD/75um ID) | Molex (Polymicro Technologies) | 106815-0018 | Used for intra-pipette perfusion system |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Potassium aspartate | Sigma-Aldrich | A6558 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M4880 | |
| Mg-ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| PIPES | Sigma-Aldrich | P6757 | |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| Apyrase | Sigma-Aldrich | A6535 | |
| Phosphatidylinositol(4,5) bisphosphate diC8 | Echelon Biosciences | P-4508 | |
| Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate diC8 | Echelon Biosciences | P-3908 | |
References
- Rives, M. L., Javitch, J. A., Wickenden, A. D. Potentiating SLC transporter activity: Emerging drug discovery opportunities. Biochem Pharmacol. , (2017).
- Kang, T. M., Markin, V. S., Hilgemann, D. W. Ion fluxes in giant excised cardiac membrane patches detected and quantified with ion-selective microelectrodes. J Gen Physiol. 121 (4), 325-347 (2003).
- Babich, V., Vadnagara, K., Di Sole, F. The biophysical and molecular basis of intracellular pH sensing by Na+/H+ exchanger-3. FASEB J. 27 (11), 4646-4658 (2013).
- Fuster, D., Moe, O. W., Hilgemann, D. W. Steady-state function of the ubiquitous mammalian Na/H exchanger (NHE1) in relation to dimer coupling models with 2Na/2H stoichiometry. J Gen Physiol. 132 (4), 465-480 (2008).
- Fuster, D., Moe, O. W., Hilgemann, D. W. Lipid- and mechanosensitivities of sodium/hydrogen exchangers analyzed by electrical methods. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (28), 10482-10487 (2004).
- Forster, I. C., Virkki, L., Bossi, E., Murer, H., Biber, J. Electrogenic kinetics of a mammalian intestinal type IIb Na(+)/P(i) cotransporter. J Membr Biol. 212 (3), 177-190 (2006).
- Smith, P. J., Trimarchi, J. Noninvasive measurement of hydrogen and potassium ion flux from single cells and epithelial structures. Am J Physiol Cell Physiol. 280 (1), C1-C11 (2001).
- Parker, M. D., Musa-Aziz, R., Boron, W. F. The use of extracellular, ion-selective microelectrodes to study the function of heterologously expressed transporters in Xenopus oocytes. Am J Physiol Cell Physiol. 296 (5), C1243 (2009).
- Smith, P. J. S., Sanger, R. H., Messerli, M. A., Michael, A. C., Borland, L. M. . Electrochemical Methods for Neuroscience. , 373-406 (2007).
- Orlowski, J., Grinstein, S. Diversity of the mammalian sodium/proton exchanger SLC9 gene family. Pflugers Arch. 447 (5), 549-565 (2004).
- Brett, C. L., Donowitz, M., Rao, R. Evolutionary origins of eukaryotic sodium/proton exchangers. Am J Physiol Cell Physiol. 288 (2), C223-C239 (2005).
- Bobulescu, I. A., Di Sole, F., Moe, O. W. Na+/H+ exchangers: physiology and link to hypertension and organ ischemia. Curr Opin Nephrol Hypertens. 14 (5), 485-494 (2005).
- Donowitz, M., Ming Tse, C., Fuster, D. SLC9/NHE gene family, a plasma membrane and organellar family of Na(+)/H(+) exchangers. Mol Aspects Med. 34 (2-3), 236-251 (2013).
- Zachos, N. C., Tse, M., Donowitz, M. Molecular physiology of intestinal Na+/H+ exchange. Annu Rev Physiol. 67, 411-443 (2005).
- Girardi, A. C., Di Sole, F. Deciphering the mechanisms of the Na+/H+ exchanger-3 regulation in organ dysfunction. Am J Physiol Cell Physiol. 302 (11), C1569-C1587 (2012).
- Bobulescu, I. A., Moe, O. W. Na+/H+ exchangers in renal regulation of acid-base balance. Semin Nephrol. 26 (5), 334-344 (2006).
- Hilgemann, D. W., Feng, S., Nasuhoglu, C. The complex and intriguing lives of PIP2 with ion channels and transporters. Sci STKE. (111), re19 (2001).
- Mohan, S., et al. NHE3 activity is dependent on direct phosphoinositide binding at the N terminus of its intracellular cytosolic region. J Biol Chem. 285 (45), 34566-34578 (2010).
- Alexander, R. T., et al. Membrane surface charge dictates the structure and function of the epithelial Na+/H+ exchanger. EMBO J. 30 (4), 679-691 (2011).
- Wang, T. M., Hilgemann, D. W. Ca-dependent nonsecretory vesicle fusion in a secretory cell. J Gen Physiol. 132 (1), 51-65 (2008).
- Hilgemann, D. W., Sakmann, B., Neher, E. . Single-Channel Recording. , 307-328 (1995).
- Hilgemann, D. W., Lu, C. C. Giant membrane patches: improvements and applications. Methods Enzymol. 293, 267-280 (1998).
- Matsuoka, S., Takeuchi, A., Okada, Y. . Patch Clamp Techniques. , 207-218 (2012).
- Pouyssegur, J., Sardet, C., Franchi, A., L’Allemain, G., Paris, S. A specific mutation abolishing Na+/H+ antiport activity in hamster fibroblasts precludes growth at neutral and acidic pH. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (15), 4833-4837 (1984).
- Voipio, J., Pasternack, M., MacLeod, K., Ogden, D. . Microelectrode Techniques – The Plymouth Workshop Handbook. , 275-316 (1994).
