Toepassing van electrofysiologie meting op het bestuderen van de activiteit van Electro-neutrale Transporters
Summary
Dit manuscript beschrijft de toepassingen van proton-Ionselectieve electroden en patch klemmen van methoden voor het meten van de activiteit van proton vervoerssystemen. Deze methoden zijn sommige beperkingen van technieken gebruikt bij het bestuderen van proton vervoersactiviteit, zoals matige gevoeligheid, resolutie van de tijd en onvoldoende intracellulaire milieu controle.
Abstract
Het transport van ionen via celmembranen zorgt voor het fijne controle van ion inhoud binnen en buiten de cel die onontbeerlijk is voor de overleving van de cel. Deze vervoer mechanismen zijn gemedieerd door de activiteiten van gespecialiseerde vervoerder eiwitten. Specifiek, pH dynamics fijn worden gecontroleerd door plasmamembraan proton (H+) extrusie systemen, zoals de nb+/H+ warmtewisselaar (NHE) eiwit familie. Ondanks uitgebreide inspanningen om te bestuderen van de mechanismen die ten grondslag liggen aan de verordening NHE, is ons huidige begrip van de biofysische en moleculaire eigenschappen van de familie NHE ontoereikend vanwege de beperkte beschikbaarheid van methoden om te meten effectief NHE activiteit . In dit manuscript, gebruikten we H+-Ionselectieve electroden tijdens geheel-cel patch klemmen opname voor het meten van NHE-geïnduceerde H+ flux. Wij hebben voorgesteld deze aanpak te overwinnen sommige beperkingen van meestal gebruikte methoden voor het meten van NHE activiteit, zoals opname van radioactieve en fluorescerende membraan permeants. Meten van NHE activiteiten met behulp van de beschreven methode maakt hoge gevoeligheid en tijd resolutie en een efficiëntere controle op intracellulaire concentraties van de H+ . H+-Ionselectieve electroden zijn gebaseerd op het feit dat de vervoerder activiteit maakt een ion-verloop in de nabijheid van de celmembraan. Een H+-selectieve elektrode tot verplaatsen en weg van het celmembraan in een repetitieve, oscillerende manier registreert een spanningsverschil die is afhankelijk van H+ flux. Terwijl H+-Ionselectieve electroden worden gebruikt voor het detecteren van H+ flux verhuizen van de cel, de patch klem methode in het geheel-cel-configuratie moet worden gebruikt voor de samenstelling van het intracellulair ion. Toepassing van de reus patch-clamp techniek staat bovendien, wijziging van de intracellulaire samenstelling van niet alleen de ionen, maar ook de lipiden. De activiteit van de vervoerder van NHE isovorm 3 (NHE3) werd gemeten met behulp van deze technische aanpak te bestuderen van de moleculaire basis van de verordening van de NHE3 door phosphoinositides.
Introduction
Transport van ionen en opgeloste stoffen over het plasma-membraan is essentieel voor de overleving van de cellen en dus van organismen1. Selectieve transport van ionen en opgeloste stoffen wordt bereikt door een scala aan gespecialiseerde kanaal en vervoerder eiwitten. Mutaties in deze eiwitten vaak resulteren in een verscheidenheid van klinische omstandigheden, waardoor kanaal en vervoerder eiwitten doelwit voor farmacologische behandeling1. Inzicht in de mechanismen die ten grondslag liggen aan kanaal en vervoerder functie en verordening wordt echter vaak beperkt door de benaderingen ter studie van hun activiteit2,3,4.
Specifiek, vervoerders kunnen worden grofweg onderverdeeld in twee grote groepen afhankelijk van of ze de transmembrane potentieel van cel tijdens het transport van opgeloste stoffen wijzigen: de veranderen electrogenic ion vervoerders [bv -natriumfosfaat Co vervoerder 2a (NaPi2a), natrium-calcium exchanger (NCX), enz.] of de transporteurs electroneutral-ion niet-wijzigen [bijvoorbeeld natrium-proton exchanger (NHE), natriumchloride co vervoerder, NaPi2c, enz.]. De activiteiten van beide klassen van transporteurs zijn bestudeerd uitgebreid met opname van radioactieve isotopen en membraan-permeant fluorescerende kleurstoffen2. Beide benaderingen schatten de activiteit van transporteurs door het meten van veranderingen in de concentratie van de bulk van specifieke cytoplasmatische ionen, en beide methoden hebben beperkingen, zoals matige gevoeligheid en de resolutie van de tijd en onvoldoende controle van de intracellulaire milieu. Inderdaad, de activiteit van veel vervoerders is afhankelijk van de cytoplasmatische concentratie van de uitgevoerd ionen (bijvoorbeeld NHE3, NCX), en veranderingen in deze ion concentraties worden verwacht om te spelen een belangrijke rol bij het reguleren van de vervoerder activiteit2 , 3 , 5. nauwkeurige meting van deze regulerende mechanismen is beperkt met behulp van de klassieke methoden.
Deze beperkingen wilt opheffen, worden patch klem methoden gebruikt voor het bestuderen van de vervoerder activiteit2,6. In het bijzonder hebben de naar zichzelf verwijzen ion-Ionselectieve electroden (ISEs)7,8 in combinatie met de patch klemmen systeem onlangs de meting van electroneutral transporter activiteit3,4 , 5. ISEs zijn gebaseerd op het feit dat de vervoerder activiteit maakt een ion-verloop in de nabijheid van de celmembraan. Een ISE omhoog te bewegen en buiten de celmembraan in een repetitieve, registreert oscillerende mode een spanningsverschil (µV). Ion flux waarden met behulp van een kalibratie-methode die van toepassing de eerste wet van Fick van diffusie2,9 iskunnen verschillen van de spanning worden omgezet. Terwijl ISEs worden gebruikt om te ontdekken de flux van ionen verplaatsen van cellen, de patch klem methode in beide geheel-cel of binnenstebuiten configuraties wordt gebruikt voor het bepalen van de samenstelling van de potentiële en intracellulaire ion membraan. Bovendien kan de toepassing van de gigantische patch-clamp techniek wijziging van de intracellulaire samenstelling van niet alleen de ionen, maar ook lipiden en eiwitten3,5.
Kortom vergeleken de veelzijdigheid van de patch klem methode met dat van andere methoden om te studeren vervoerder activiteit patch klemmen geschikt geboekt voor het overwinnen van de gemeenschappelijke beperkingen van deze andere methoden. De combinatie van zichzelf verwijzende ISEs en patch-clamp technieken biedt de unieke mogelijkheid om het meten van de activiteit van electroneutral vervoerders in een strak gecontroleerde experimentele omgeving en te ontdekken roman biofysische en moleculaire eigenschappen van de celmembraan vervoer3,4,5. Deze aanpak is met succes gebruikt voor het bestuderen van de activiteit van de NHE. De zoogdieren NHE eiwit familie katalyseert de uitwisseling electroneutral netto van extracellulaire natrium (Na+) voor de intracellulaire proton (H+)10,11 met behulp van een innerlijke nb+ verloop. Bij zoogdieren bevat de NHE eiwit familie 11 verwante proteïnen (NHE1-9 en NHA1-2) en een sperma-specifieke NHE10,12,13.
NHEs (familie SLC9a) zijn overal te vinden in de meeste levende organismen van eenvoudige prokaryoten aan hogere eukaryoten en zijn betrokken bij een scala aan vitale cel functies10,11, met inbegrip van controle op de cel zoutgehalte verdediging in prokaryoten, zuur-base homeostase en cel volume onderhouden en reguleren van de absorptie van zout en water in verschillende gespecialiseerde epithelen10,12,14,15. De belangrijkste biologische rol van NHEs en de betekenis van hun functies zijn vastgesteld door middel van verschillende studies; echter hebben weinig studies onderzocht de biofysische en moleculaire eigenschappen van zoogdieren afkomstig NHEs vanwege de methodologische beperkingen4. Onlangs, de toepassing van zichzelf verwijzende ISEs tijdens het geheel-cel patch klemmen heeft geopenbaard nieuwe moleculaire mechanismen van NHE isoforms geregeld door veranderingen in de intracellulaire concentraties van ionen, eiwitten en fosfolipiden3, 4.
Met name het protocol waarin dit manuscript schetst de methodes en benaderingen voor de studie van de activiteit en regulering van NHE isovorm 3 (NHE3), een belangrijke speler in de absorptie van nb+, Cl–, HCO3– en vloeistof in de borstel grens membraan van nier- en intestinale epithelen14,16. Nieuw inzicht in de verschillen in de gevoeligheid van NHE3 activiteit aan intracellulaire phosphoinositides (phosphatidylinositide 4,5-difosfaat [PI (4,5) P2] en phosphatidylinositide 3,4,5-trifosfaat [PI(3,4,5]P3]) is gemeld. Cel vervoer eiwitten, zoals kanalen en vervoerders, worden geregeld door phosphoinositides17en NHE3 direct bindt zowel PI (4,5) P2 en P3 PI (3,4,5)18. Op basis van de huidige literatuur, ofwel phosphoinositide zou relevant kunnen zijn voor de fysiologische of pathofysiologische regulering van NHE35,18,19. Onze bevindingen ondersteunen aparte rollen voor PI (4,5) P2 en P3 van de PI (3,4,5) in de regulatie van NHE3 activiteit. Dit onderscheid werd mogelijk door de toepassing van ISE technieken in combinatie met geheel-cel patch klem opname. Deze techniek biedt ook controle over de inhoud phosphoinositide cellulaire via de intracellulaire perfusie van verschillende phosphoinositides tijdens de meting van NHE3 activiteit.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ondanks de cruciale functies van vervoerders zijn de methoden beschikbaar voor het bestuderen van hun activiteit inefficiënt en ontoereikend. Een beperking is dat de beschikbare methoden ion verkeer gemedieerd door vervoerder activiteit zonder rekening van schommelingen in de samenstelling van het intracellulair ion tijdens het experiment4te meten. De onderhavige methode zorgt voor nauwkeurige controle van extracellulaire en intracellulaire ion composities en biedt een krachtig hulpmiddel voor he…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedank Eric Fishback (Des Moines University, Des Moines, Iowa, VSA) voor zijn hulp bij het fotograferen en bewerken van de video. De PS120 fibroblast-achtige cellen stabiel uiting van NHE3-wt of NHE3-YRK werden vriendelijk geleverd door Dr. Mark Donowitz (Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, MD, USA).
Materials
| Patch clamp Amplifier | Molecular Devices | ||
| Dual Channel Differential Electrometer (HiZ-223) | Warner Instruments | 64-1650 | |
| Differential Amplifier (DP-301) | Warner Instruments | 64-0044 | |
| Patch Clamp Software Based on MatLab | MatLab with acquisition toolbox | The capmeter software is recommended | |
| ThermoClamp-1 Temperature Control System | AutoMate Scientific | 03-11-LL | In-line heater |
| Single-Channel Temperature Controller (TC-324C) | Warner Instruments | 64-2400 | |
| Single-Barrel Standard Borosilicate Glass Tubing | World Precision Instruments | 1B120F-3 | Used for ion selective electrodes |
| Micropipette Storage Jar | World Precision Instruments | E212 | |
| Bis(dimethylamino)dimethylsilane | Sigma-Aldrich | 14755-100ML | |
| Carbon tetrachloride | Sigma-Aldrich | 319961-500ML | |
| Hydrogen ionophore I – cocktail B | Sigma-Aldrich | 95293 | |
| Thin Wall Borosilicate Tubing | Sutter Instrument | B200-156-15 | Used for patch clamp pipette |
| Soft glass (Corning 8161 Patch Glass) | Warner Instruments | 64-0815 | |
| Silica Capillary Tubing (150um OD/75um ID) | Molex (Polymicro Technologies) | 106815-0018 | Used for intra-pipette perfusion system |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Potassium aspartate | Sigma-Aldrich | A6558 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M4880 | |
| Mg-ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| PIPES | Sigma-Aldrich | P6757 | |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| Apyrase | Sigma-Aldrich | A6535 | |
| Phosphatidylinositol(4,5) bisphosphate diC8 | Echelon Biosciences | P-4508 | |
| Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate diC8 | Echelon Biosciences | P-3908 | |
References
- Rives, M. L., Javitch, J. A., Wickenden, A. D. Potentiating SLC transporter activity: Emerging drug discovery opportunities. Biochem Pharmacol. , (2017).
- Kang, T. M., Markin, V. S., Hilgemann, D. W. Ion fluxes in giant excised cardiac membrane patches detected and quantified with ion-selective microelectrodes. J Gen Physiol. 121 (4), 325-347 (2003).
- Babich, V., Vadnagara, K., Di Sole, F. The biophysical and molecular basis of intracellular pH sensing by Na+/H+ exchanger-3. FASEB J. 27 (11), 4646-4658 (2013).
- Fuster, D., Moe, O. W., Hilgemann, D. W. Steady-state function of the ubiquitous mammalian Na/H exchanger (NHE1) in relation to dimer coupling models with 2Na/2H stoichiometry. J Gen Physiol. 132 (4), 465-480 (2008).
- Fuster, D., Moe, O. W., Hilgemann, D. W. Lipid- and mechanosensitivities of sodium/hydrogen exchangers analyzed by electrical methods. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (28), 10482-10487 (2004).
- Forster, I. C., Virkki, L., Bossi, E., Murer, H., Biber, J. Electrogenic kinetics of a mammalian intestinal type IIb Na(+)/P(i) cotransporter. J Membr Biol. 212 (3), 177-190 (2006).
- Smith, P. J., Trimarchi, J. Noninvasive measurement of hydrogen and potassium ion flux from single cells and epithelial structures. Am J Physiol Cell Physiol. 280 (1), C1-C11 (2001).
- Parker, M. D., Musa-Aziz, R., Boron, W. F. The use of extracellular, ion-selective microelectrodes to study the function of heterologously expressed transporters in Xenopus oocytes. Am J Physiol Cell Physiol. 296 (5), C1243 (2009).
- Smith, P. J. S., Sanger, R. H., Messerli, M. A., Michael, A. C., Borland, L. M. . Electrochemical Methods for Neuroscience. , 373-406 (2007).
- Orlowski, J., Grinstein, S. Diversity of the mammalian sodium/proton exchanger SLC9 gene family. Pflugers Arch. 447 (5), 549-565 (2004).
- Brett, C. L., Donowitz, M., Rao, R. Evolutionary origins of eukaryotic sodium/proton exchangers. Am J Physiol Cell Physiol. 288 (2), C223-C239 (2005).
- Bobulescu, I. A., Di Sole, F., Moe, O. W. Na+/H+ exchangers: physiology and link to hypertension and organ ischemia. Curr Opin Nephrol Hypertens. 14 (5), 485-494 (2005).
- Donowitz, M., Ming Tse, C., Fuster, D. SLC9/NHE gene family, a plasma membrane and organellar family of Na(+)/H(+) exchangers. Mol Aspects Med. 34 (2-3), 236-251 (2013).
- Zachos, N. C., Tse, M., Donowitz, M. Molecular physiology of intestinal Na+/H+ exchange. Annu Rev Physiol. 67, 411-443 (2005).
- Girardi, A. C., Di Sole, F. Deciphering the mechanisms of the Na+/H+ exchanger-3 regulation in organ dysfunction. Am J Physiol Cell Physiol. 302 (11), C1569-C1587 (2012).
- Bobulescu, I. A., Moe, O. W. Na+/H+ exchangers in renal regulation of acid-base balance. Semin Nephrol. 26 (5), 334-344 (2006).
- Hilgemann, D. W., Feng, S., Nasuhoglu, C. The complex and intriguing lives of PIP2 with ion channels and transporters. Sci STKE. (111), re19 (2001).
- Mohan, S., et al. NHE3 activity is dependent on direct phosphoinositide binding at the N terminus of its intracellular cytosolic region. J Biol Chem. 285 (45), 34566-34578 (2010).
- Alexander, R. T., et al. Membrane surface charge dictates the structure and function of the epithelial Na+/H+ exchanger. EMBO J. 30 (4), 679-691 (2011).
- Wang, T. M., Hilgemann, D. W. Ca-dependent nonsecretory vesicle fusion in a secretory cell. J Gen Physiol. 132 (1), 51-65 (2008).
- Hilgemann, D. W., Sakmann, B., Neher, E. . Single-Channel Recording. , 307-328 (1995).
- Hilgemann, D. W., Lu, C. C. Giant membrane patches: improvements and applications. Methods Enzymol. 293, 267-280 (1998).
- Matsuoka, S., Takeuchi, A., Okada, Y. . Patch Clamp Techniques. , 207-218 (2012).
- Pouyssegur, J., Sardet, C., Franchi, A., L’Allemain, G., Paris, S. A specific mutation abolishing Na+/H+ antiport activity in hamster fibroblasts precludes growth at neutral and acidic pH. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (15), 4833-4837 (1984).
- Voipio, J., Pasternack, M., MacLeod, K., Ogden, D. . Microelectrode Techniques – The Plymouth Workshop Handbook. , 275-316 (1994).
