Procedure di trapianto ovarico di Orthotopic per studiare l'influenza di durata di vita e di salute della senescenza ovarica nei topi femmina
Summary
È descritti qui orthotopic protocolli di trapianto ovarico per modificare ovarico influenza sulla fisiologia del destinatario mouse. Questa procedura chirurgica viene utilizzata per esporre topi femmina a vari tipi di influenza ovarico e può includere eterocronico trapianti e trapianto delle ovaie che hanno subito i vari trattamenti di ex vivo .
Abstract
Trapianto ovarico in primo luogo è stato condotto presso la Utah State University nel 1963. Nei lavori più recenti, mediante trapianto delle ovaie dei mammiferi è utilizzato per studiare gli effetti di salute-protettivo del giovane ovaie in giovani femmine. Le attuali procedure di impiegano un metodo di trapianto ortotopico, dove allogenico ovaie vengono trapiantate nella loro posizione originale a bursa ovarico. Questo è in contrasto con il più comunemente usato heterotopic trapianto di tessuto ovarico/ovaie per via sottocutanea o sotto la capsula del rene. Tutti e tre posizioni forniscono efficiente rivascolarizzazione dei tessuti trapiantati. Tuttavia, trapianto orthotopic fornisce l’ovaio con l’ambiente di segnalazione più naturale ed è l’unica procedura che offre l’opportunità per l’animale di riprodursi naturalmente postoperatorio. Uno deve fare attenzione a rimuovere tutto il tessuto ovarico endogeno durante la procedura di ovariectomia. Se qualsiasi tessuto endogeno rimane o se solo un’ovaia viene rimosso, il tessuto trapiantato rimarrà dormente fino a che il tessuto esistente diventa senescente. Mentre la rivascolarizzazione delle ovaie trapiantate si verifica molto rapidamente, il destinatario del trapianto può richiedere una notevole quantità di tempo per adattarsi ad un nuovo ipotalamo/ipofisi/gonadi/surrene (HPG/A) asse regime associato con il trapiantato di segnalazione tessuto. Questo normalmente dura circa 100 giorni nel topo. Quindi, esperimenti di trapianto dovrebbero essere progettati per ospitare questo periodo di adattamento. Risultati tipici con trapianto ovarico includono cambiamenti nella salute del destinatario che riflettono l’età dell’ovaia trapiantato, piuttosto che l’età cronologica del destinatario.
Introduction
L’influenza di riproduzione sulla salute e la durata di vita è spesso erroneamente pensato come limitato solo al periodo che comprende la competenza riproduttiva. Mentre il lifestyle e fenotipi associati con la fase riproduttivo competente della durata sono facilmente distinguibili dalle fasi pre- e postreproductive, lo stato riproduttivo influenza la salute in tutte le fasi della durata. Il periodo di competenza riproduttiva si riferisce spesso come la durata della vita riproduttiva, differenziandosi dall’arco cronologico di vita. Questa terminologia si presta ad una separazione artificiale delle due denominazioni durata quando in realtà, entrambi sono strettamente legato un l’altro con gli eventi che interessano uno, più spesso, che colpisce l’altro pure.
Prova nell’ultimo decennio indica che lo stato riproduttivo di un individuo è associato con un rischio aumentato di sviluppare cronici delle condizioni1. Uno studio ha documentato un’associazione tra durate più brevi e problemi riproduttivi per un gruppo di uomini2. L’associazione è ancora più evidente nelle donne. La malattia cardiovascolare è rara in donne premenopausal3, ma insufficienza ovarica aumenta la malattia cardiovascolare acutamente a menopausa4 e in giovani donne con guasto ovarico prematuro5. Perdita di osso e6 di resistenza di insulina aumentano a menopausa7 e quasi due terzi degli americani con il morbo di Alzheimer sono donne8. Cambiamenti ben definite nella segnalazione ovarico segnano il passaggio da uno stato di premenopausa, resistenti alle malattie, a uno stato postmenopausa, gravati di malattia. Questa transizione stabile, rappresenta un’opportunità per identificare i meccanismi che accelerano i rischi di malattia nell’invecchiamento.
Recentemente, il trapianto di tessuto ovarico crioconservati è stato utilizzato per ripristinare la fertilità in donne che subiscono le procedure mediche che potrebbero compromettere le cellule germinali, come la chemioterapia. Trapianto di tessuto ovarico può essere utilizzato anche per produrre la prole vitali in animali con sterilità di base non-ovarico, compreso topi transgenici9. Trapianto ovarico è un metodo efficace per separare l’influenza della funzione riproduttiva o invecchiamento riproduttivo da invecchiamento cronologico per sé.
Il ruolo di sostegno ben consolidato per ormoni ovarici in molti aspetti della salute femminile implica la perdita di produzione di ormoni da ciclismo attivamente le cellule di germe, come la principale causa dei rischi di malattia aumentata a menopausa. Mentre il valore degli ormoni ovarici in salute della donna è indiscutibile, sostituzione di questi ormoni in peri – e postmenopausa è stato inaffidabile nel restauro di benefici per la salute apprezzato da giovani donne con le ovaie giovane. Questi benefici per la salute vengono ripristinati in modo affidabile da eterocronico trapianto delle ovaie giovane a topi femmina postreproductive10,11,12,13,14.
Lo stato riproduttivo dei topi del donatore e del ricevente dovrebbe essere determinato prima e dopo trapianto o ovariectomia procedure. Presuntivi topi postreproductive che mostrano segni di input gonadica prima dell’intervento a 12 mesi dell’età sono esclusi da questi esperimenti. Ingresso gonadica è determinata dalla citologia vaginale. Dati su citologia vaginale sono raccolti per la pre-chirurgia almeno 10 giorni consecutivi garantire uno stato postreproductive in topi destinatari e ovaie attivamente-ciclismo nei topi di donatore. Ciclo di estro è definito come il periodo dal giorno epiteliale cellule nucleate prima che venga visualizzato uno (cioè, proestro) fino al giorno precedente la successiva apparizione di cellule nucleate epiteliale nello striscio vaginale, purché non vi sia un periodo di leucocitic presenza (cioè, diestro) in mezzo. Estro è determinato dalla presenza di cellule epiteliali squamose, grandi, con o senza nuclei. Topi che non visualizzare alcuna attività ciclica, per un periodo di 10 giorni prima e/o dopo la chirurgia sono determinato ad non avere nessun input gonadico per detto periodo. Topi che visualizzare almeno un ciclo estrale completo in un periodo di 10 giorni prima e/o dopo la chirurgia sono determinato ad avere ingresso gonadica per detto periodo. Topi femmina dovrebbero essere alloggiati in presenza di topo maschio o esposti a biancheria sporca dalla gabbia di un maschio per garantire la costante esposizione a stimoli che inducono ciclo.
Queste procedure di trapianto sono compiute in modo più efficiente con due chirurghi operano simultaneamente sul donatore e destinatari topi. Tuttavia, le procedure sono facilmente realizzabile da un chirurgo, con ovaie donatore più spesso recuperate prima di iniziare la procedura di ovariectomia sul destinatario mouse. Questo protocollo descrive la procedura per il singolo chirurgo. Esposizione del tratto riproduttivo e la chiusura del sito avviene normalmente senza un microscopio, considerando che la rimozione e la sostituzione delle ovaie è fatto sotto un microscopio. Come con qualsiasi procedura chirurgica di apprendimento, siti di incisione possono essere più grandi e gli ambulatori possono richiedere più tempo durante la procedura di apprendimento prima e sarà generalmente diminuisce con l’esperienza.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’ovariectomia e trapianto delle ovaie intatte e delle cellule di germe-vuotati sono stati condotti in topi che vanno da 21 giorni a 18 mesi di età. Quando si esegue un’ovariectomia dove è desiderabile mantenere la borsa ovarica intatta, si deve prestare attenzione quando incidendo il tessuto bursal. Nei topi di età superiore a sei mesi di età, tanto di bursa diventa sovrapposto con il cuscinetto di grasso, che limita le aree che possono essere utilizzate per l’accesso. In questi casi, è spesso vantaggioso per strap…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ricerca riportata in questa pubblicazione è stata sostenuta da un generoso dono di topi CBA femminili di 14 mesi dall’Istituto nazionale su invecchiamento, invecchiato roditore Colonia (Nancy Nadon) e da Utah State University, scuola di medicina veterinaria, dipartimento di animali, prodotti lattiero-caseari e scienze veterinarie.
Materials
| Dissecting microscope | Any dissecting scope with an adjustable working distance. | ||
| Warm Water Recirculator and appropriate pad for your size surgical/recovery field. | Stryker/Gaymar | TP700 | Circulating water pads produce even and consistent temperature operating and recovery fields. |
| Surgical instruments-dissection instruments for access to the reproductive tract | Choice of specific surgical instruments is highly surgeon-specific | ||
| Surgical instruments-fine instruments for the transplantation procedure. | Choice of specific surgical instruments is highly surgeon-specific | ||
| Suture material for abdominal wall | eSutures | G3756K: 6-0 MILD CHROMIC GUT 18" HE-7 CUTTING, DOUBLE ARMED | |
| Suture material for ovarian bursa | eSutures | 2809G: 9-0 or 2810G: 10-0 ETHILON BLACK 5" BV130-5 TAPER | 10-0 suture can be difficult to locate if dropped on the surgery field. |
| Absorbable gelatin sponge | PFIZER. | Gelfoam- PFIZER 09-0315-08. | cut into small (~2mm) pieces under sterile conditions. |
| Staples for skin closure | Becton Dickinson | MikRon Autoclip 9mm (BD 427631) | |
| Eye ointment. | MWI Veterinary Supply Co. | Puralube sterile opthalmic ointment | |
| Syringes for anesthesia, analgesia and epinephrine | MWI Veterinary Supply Co. | BD 305536 | 27g x 3/8in,Intradermal Bevel 1/2ml |
| Syringes for saline. | MWI Veterinary Supply Co. | BD 309657. | 3ml syringe, luer-lok tip, 27g needle |
| Clippers/blade | Andis | Super AGR+™ Cordless Detachable Blade Clipper and a CeramicEdge® #40 blade. | Any clippers with a fine blade. |
| Ethanol | University chemical supply | dilute to 70% for use. | |
| Betadine solution | MWI Veterinary Supply Co. | 003233 | |
| 2×2 gauze pads | MWI Veterinary Supply Co. | 003073 | autoclaved with surgery packs |
| Borosilicate glass beads | Sigma-Aldrich Co. | Z273619 | Autoclave in sintilation vials |
| 4-vinylcyclohexene diepoxide | Sigma-Aldrich Co. | 94956 | |
| Sesame oil | Sigma-Aldrich Co. | S3547 |
References
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