Роман В Vitro Live изображений Assay экзоцитоз-опосредованной с помощью фагоцитоза pH индикатор конъюгированных синаптосомах
Summary
Этот протокол представляет в vitro жить изображений фагоцитоза assay для измерения фагоцитарной способности астроциты. Астроциты очищенный крыса и микроглии используются наряду с синаптосомах конъюгированных показатель рН. Этот метод может обнаружить реального времени полного охвата контейнера пламенем и деградации кинетики и предоставляет платформу подходящий скрининг для выявления факторов, модулирует экзоцитоз фагоцитоза.
Abstract
Астроциты являются типом крупных клеток в головном мозге и напрямую связаться с синапсов и кровеносных сосудов. Хотя Микроглии клеток были рассмотрены основные иммунные клетки и только фагоцитов в головном мозге, недавние исследования показали, что Астроциты также принимают участие в различных процессах фагоцитоза, например развития синапса ликвидация и удаление бета-амилоидных бляшек в болезни Альцгеймера (AD). Несмотря на эти выводы эффективность поглощения экзоцитоз и деградации их целей является неясным по сравнению с микроглии. Это отсутствие информации обусловлено главным образом отсутствием пробирного системы, в котором легко сопоставимы кинетика экзоцитоз – и микроглии опосредованной фагоцитоза. Для достижения этой цели, мы разработали долгосрочный жить изображений в пробирке фагоцитоза анализа для оценки фагоцитарной способности очищенный астроциты и микроглии. В этот assay возможно с помощью РН конъюгированных индикатор синаптосомах, выделяющие ярко красной флуоресценции в кислой органеллы, например лизосомы реального времени обнаружения поглощения и деградации. Наш Роман пробирного обеспечивает простое и эффективное обнаружение фагоцитоза путем жить изображений. Кроме того этот в vitro фагоцитоза assay может использоваться как платформа скрининга для выявления химических веществ и соединений, которые могут повысить или препятствовать фагоцитарной способности астроциты. Как было показано, что синаптических обрезка неисправности и накопление патогенных белка причиной психических расстройств или нейродегенеративных заболеваний, химических веществ и соединений, которые модулируют фагоцитарной способности глиальные клетки должны быть полезны в лечении различных неврологические расстройства.
Introduction
Глиальные клетки, которые относятся к не возбудимых клеток в головном мозге, являются основным клетки типа в центральной нервной системе (ЦНС). Ранее глиальные клетки были расценены как просто вспомогательные клетки, которые главным образом играть пассивная роль в поддержании выживаемость нейронов и базальной синаптических свойства. Однако новые данные показали, что глиальные клетки играть более активную роль в различных аспектах нейробиологии, таких как поддержание гомеостаза головного мозга, посредничество синапса формирования1,2,3 и СИНАПС ликвидации4,5и модулирующая синаптической пластичности6,7. Глиальные клетки в ЦНС включают астроциты, Микроглия и олигодендроциты. Среди этих клеток, астроциты и микроглии показали играть фагоцитарной роли путем поглощение синапсы4,5, apoptotic клетки8, нейронные мусора9и патогенных белков, таких как бета амилоида бляшки10,11. В развитие мозга астроциты устранить синапсов в спинной латеральное коленчатое (dLGN) через MERTK – и MEGF10-зависимой фагоцитоза4. Аналогичным образом микроглии также устранить C1q-покрытием синапсы этапах развития через каскад классической дополнением5. Интересно, что было высказано предположение о том, что дефекты в синапсе Обрезка может быть одним из инициаторов нескольких неврологических расстройств. Например было показано, что мутации в компонент 4 (C4), в которых увеличивается дополнение опосредованной синапса обрезка микроглии, сильно связаны с преобладанием шизофрении в людей12. Недавний документ также показал, что путь классической дополнением гиперактивными в стадии инициации AD и индуцирует ранних синапса потери в этой болезни13.
По сравнению с микроглии опосредованной фагоцитоза, ли экзоцитоз опосредованной фагоцитоза способствует инициации и прогрессирования различных неврологических расстройств является менее ясным. Однако недавний документ свидетельствует о том, что факторы, которые изменяют уровень нормальной синапса обрезки, астроциты может подорвать гомеостаза головного мозга и способствовать AD восприимчивость и патологии14. Уровень обрезки синапса, астроциты мощно контролируется ароЕ изомеров, с защитной аллеля для AD (ApoE2) сильно повышение скорость и риск аллеля для AD (ApoE4) значительно снижение ставки. Кроме того трансгенных мышей, выражая ApoE4 накопленных гораздо больше синаптических C1q чем ApoE2 мышей14или управления. Эти данные позволяют предположить, что нарушение экзоцитоз опосредованной фагоцитоза в начале объявления мозга может вызвать накопление стареющей C1q-покрытием синапсы/синаптической мусора, который активирует фагоцитоз дополнение опосредованной микроглии, вождение синаптических дегенерация . Нарушением фагоцитарной способности астроциты в ApoE4 перевозчиков может также способствовать бесконтрольное накопление бета-амилоидных бляшек в ад затронутых мозги.
Кроме того было показано, что глиальные клетки в возрасте мозг дрозофилы потерять их фагоцитарной способности благодаря снижению перевод Дрейпер, гомолога Megf10 , астроциты использовать для phagocytosing синапсов. Восстановление уровней Дрейпер спасли фагоцитарной способности глиальных клеток, которые эффективно очистить поврежденные аксональное мусора в возрасте мозг в подобные степени, что в молодой мозга, указав, что старение индуцированной изменения в фагоцитарной способности Астроциты могут способствовать нарушению гомеостаза головного мозга15.
Основываясь на этих новых результатов, модулирует фагоцитарной способности астроциты может быть привлекательным терапевтические стратегии для профилактики и лечения различных неврологических расстройств. В этой связи там было несколько попыток повышения фагоцитарной способности астроциты, например, вызывающих подкисление лизосом с кислой наночастиц16 и экспрессирующих транскрипционный фактор EB (TFEB), который может увеличить Лизосома биогенеза17. Несмотря на эти попытки, до сих пор неясно как астроциты и Микроглии клеток отличаются в их фагоцитарной кинетики и ли мы должны увеличить или уменьшить их фагоцитарной потенциала в различных заболеваний.
В этой статье мы представляем Роман в vitro assay для обнаружения фагоцитарной способности астроциты в режиме реального времени. Данные показывают различные кинетики сплошным и деградации в астроциты и микроглии. С кондиционером экзоцитоз среднего (ACM), который содержит секретируемые факторов от астроциты, имеет важное значение для эффективного фагоцитоза астроциты и микроглии. Кроме того Megf10, фагоцитарной рецепторов в астроциты и гомолога КНИ-1 и Дрейпер, играет важнейшую роль в экзоцитоз опосредованной фагоцитоза8,18.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этой статье мы представляем методы для долгосрочного жить изображений в vitro фагоцитоза assay с использованием очищенного глиальные клетки и синаптосомах конъюгированных показатель рН. Мы показываем, что по сравнению с микроглии, астроциты обладают различной емкости поглощения и ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят Ен-Джу Юнг за ее экспериментальная поддержка во время очистки synaptosome и Jungjoo парк для изображений синаптосомах с PS экспозиции. Кроме того мы благодарим всех членов в лаборатории Чун для полезной дискуссии. Эта работа была поддержана в Национальный исследовательский фонд Кореи (NRF) Грант, финансируемых правительством Кореи (MSIP) (NRF-2016M3C7A1905391 и СР 2016R1C1B3006969) (W.-S. C).
Materials
| Synaptosome purification | |||
| Percoll | GE healthcare life sciences | 17-0891-01 | |
| Quick Start Bradford Protein Assay Kit 2 | BIO-RAD | 5000202 | |
| pH indicator conjugation | |||
| Dimethyl sulfoxide(DMSO) | LPS solution | DMSO100 | |
| pHrodo red, succinimidyl ester | Molecula probes | P36600 | |
| Immunopanning | |||
| 10X Earle’s balanced salt solution (EBSS) | Sigma | E7510 | |
| Bovine serum albumin | Bovogen | BSA025 | |
| Deoxyrebonuclease 1 (DNase) | Worthington | Is002007 | |
| (DMEM) | Gibco | 11960-044 | |
| (dPBS) | Welgene | LB001-02 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 16000-044 | |
| Griffonia Simplicifolia Lectin(BSL-1) | Vector Labs | L-1100 | |
| Goat anti-mouse IgG+IgM(H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-005-044 | |
| Goat anti-mouse IgM (μ-chain) | Jackson ImmunoResearch | 115-005-020 | |
| Heparin-binding epidermal growth factor | Sigma | E4643 | |
| Human HepaCAM antibody | R&D systems | MAB4108 | |
| Integrin beta 5 monoclonal antibody (KN52) | eBioscience | 14-0497-82 | |
| L-cysteine | Sigma | C7880 | |
| L-glutamate | Gibco | 25030-081 | |
| N-acetly-L-cyteine (NAC) | Sigma | A8199 | |
| Neurobasal media | Gibco | 21103-049 | |
| O4 hybridoma supernatant(mouse IgM) | Bansal et al.23 | ||
| Papain | Worthington | Is003126 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Pluristrainer 20 μm | PluriSelect | 43-50020-03 | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P6407 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Putrescine dihydrochloride | Sigma | P5780 | |
| Purified rat anti-mouse CD45 | BD Pharmingen | 550539 | |
| Purified mouse anti-rat CD45 | BD Pharmingen | 554875 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| Transferrin | Sigma | T1147 | |
| Trypsin | Sigma | T9935 | |
| Trypsin inhibitor | Worthington | LS003086 | |
| Ultra-clear tube (Tube, Thinwall, Ultra-Clear) | Beckman Coulter | 344059 | |
| Collect IP-ACM | |||
| Macrosep Advance Centrifugal Devices with Omega Membrane (10k) | PALL | MAP010C37 | |
| Macrosep Advance Centrifugal Devices with Omega Membrane (30k) | PALL | MAP030C37 | |
| Phagocytosis live imaging assay | |||
| Juli stage | NanoEntek | ||
| Time Series Analyzer V3 plugins | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/time-series.html |
References
- Singh, S. K., et al. Astrocytes Assemble Thalamocortical Synapses by Bridging NRX1alpha and NL1 via Hevin. Cell. 164 (1-2), 183-196 (2016).
- Allen, N. J., et al. Astrocyte glypicans 4 and 6 promote formation of excitatory synapses via GluA1 AMPA receptors. Nature. 486 (7403), 410-414 (2012).
- Xu, J., Xiao, N., Xia, J. Thrombospondin 1 accelerates synaptogenesis in hippocampal neurons through neuroligin 1. Nat Neurosci. 13 (1), 22-24 (2010).
- Chung, W. S., et al. Astrocytes mediate synapse elimination through MEGF10 and MERTK pathways. Nature. 504 (7480), 394-400 (2013).
- Schafer, D. P., et al. Microglia sculpt postnatal neural circuits in an activity and complement-dependent manner. Neuron. 74 (4), 691-705 (2012).
- Ma, Z., Stork, T., Bergles, D. E., Freeman, M. R. Neuromodulators signal through astrocytes to alter neural circuit activity and behaviour. Nature. 539 (7629), 428-432 (2016).
- Parkhurst, C. N., et al. Microglia promote learning-dependent synapse formation through brain-derived neurotrophic factor. Cell. 155 (7), 1596-1609 (2013).
- Iram, T., et al. Megf10 Is a Receptor for C1Q That Mediates Clearance of Apoptotic Cells by Astrocytes. J Neurosci. 36 (19), 5185-5192 (2016).
- Tasdemir-Yilmaz, O. E., Freeman, M. R. Astrocytes engage unique molecular programs to engulf pruned neuronal debris from distinct subsets of neurons. Genes Dev. 28 (1), 20-33 (2014).
- Jones, R. S., Minogue, A. M., Connor, T. J., Lynch, M. A. Amyloid-beta-induced astrocytic phagocytosis is mediated by CD36, CD47 and RAGE. J Neuroimmune Pharmacol. 8 (1), 301-311 (2013).
- Wang, Y., et al. TREM2 lipid sensing sustains the microglial response in an Alzheimer’s disease model. Cell. 160 (6), 1061-1071 (2015).
- Sekar, A., et al. Schizophrenia risk from complex variation of complement component 4. Nature. 530 (7589), 177-183 (2016).
- Hong, S., et al. Complement and microglia mediate early synapse loss in Alzheimer mouse models. Science. 352 (6286), 712-716 (2016).
- Chung, W. S., et al. Novel allele-dependent role for APOE in controlling the rate of synapse pruning by astrocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (36), 10186-10191 (2016).
- Purice, M. D., Speese, S. D., Logan, M. A. Delayed glial clearance of degenerating axons in aged Drosophila is due to reduced PI3K/Draper activity. Nat Commun. 7, 12871 (2016).
- Loov, C., Mitchell, C. H., Simonsson, M., Erlandsson, A. Slow degradation in phagocytic astrocytes can be enhanced by lysosomal acidification. Glia. , (2015).
- Xiao, Q., et al. Enhancing astrocytic lysosome biogenesis facilitates Abeta clearance and attenuates amyloid plaque pathogenesis. J Neurosci. 34 (29), 9607-9620 (2014).
- Lu, T. Y., et al. Axon degeneration induces glial responses through Draper-TRAF4-JNK signalling. Nat Commun. 8, 14355 (2017).
- Dunkley, P. R., Jarvie, P. E., Robinson, P. J. A rapid Percoll gradient procedure for preparation of synaptosomes. Nat Protoc. 3 (11), 1718-1728 (2008).
- Stigliani, S., et al. Glia re-sealed particles freshly prepared from adult rat brain are competent for exocytotic release of glutamate. J Neurochem. 96 (3), 656-668 (2006).
- Foo, L. C., et al. Development of a method for the purification and culture of rodent astrocytes. Neuron. 71 (5), 799-811 (2011).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), (2012).
- Cahoy, J. D., et al. A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function. J Neurosci. 28 (1), 264-278 (2008).
