Een nieuwe Live-imaging van In Vitro Assay voor Astrocyt-gemedieerde fagocytose met behulp van pH-Indicator-geconjugeerde Synaptosomes
Summary
Dit protocol biedt een in vitro live-imaging fagocytose assay voor het meten van de fagocytische capaciteit van astrocyten. Gezuiverde rat astrocyten en microglia worden gebruikt samen met pH-indicator-geconjugeerd synaptosomes. Deze methode kan detecteren real-time engulfment en afbraak kinetiek en biedt een platform geschikt screening om te identificeren factoren moduleren Astrocyt fagocytose.
Abstract
Astrocyten zijn de grote celtype in de hersenen en direct contact opnemen met synapsen en bloedvaten. Hoewel microglial cellen zijn aangemerkt de belangrijke immune cellen en alleen fagocyten in de hersenen, de recente studies hebben aangetoond dat astrocyten ook deelnemen aan diverse fagocytische processen, zoals ontwikkelingsstoornissen synapse opheffing en de ontmijning van bèta amyloid plaques in de ziekte van Alzheimer (AD). Ondanks deze bevindingen is de efficiëntie van Astrocyt engulfment en aantasting van hun doelstellingen onduidelijk vergeleken met die van microglia. Dit gebrek aan informatie is vooral te wijten aan het ontbreken van een systeem van de bepaling waarin de kinetiek van Astrocyt – en microglia-gemedieerde fagocytose gemakkelijk vergelijkbaar zijn. Om dit te bereiken, hebben we een lange termijn live-imaging in vitro fagocytose assay om te evalueren van de fagocytische capaciteit van gezuiverde astrocyten en microglia ontwikkeld. In deze test is real-time detectie van engulfment en aantasting mogelijk met behulp van de pH-indicator-geconjugeerde synaptosomes, die uitstoten van heldere rode fluorescentie in zure organellen, zoals lysosomen. Onze nieuwe assay biedt eenvoudige en doeltreffende opsporing van fagocytose via live-imaging. Daarnaast kan deze fagocytose in vitro assay worden gebruikt als een screening platform om chemische stoffen en verbindingen die kunnen verbeteren of remmen de fagocytische capaciteit van astrocyten te identificeren. Zoals synaptic snoeien storing en pathogene eiwit accumulatie is gebleken psychische stoornissen of neurodegeneratieve ziekten veroorzaken, moet chemicaliën en verbindingen die de fagocytische capaciteit van gliale cellen moduleren nuttig zijn bij de behandeling van verschillende neurologische stoornissen.
Introduction
Gliale cellen, die naar niet-prikkelbaar cellen in de hersenen verwijzen, zijn de grote celtype in het centrale zenuwstelsel (CNS). Eerder, gliale cellen werden beschouwd als louter ondersteunende cellen die voornamelijk spelen een passieve rol bij het handhaven van de basale synaptic eigenschappen en neuronale overleven. Echter, opkomende bewijs heeft geopenbaard dat gliacellen spelen een actiever rol in verschillende aspecten van neurobiologie, zoals behoud van hersenen homeostase, synaps formatie,1,,2,3 en synapse bemiddelen eliminatie4,5, en modulerende synaptische plasticiteit6,7. Gliale cellen in het VNV zijn astrocyten, microglia en oligodendrocyten. Onder deze cellen, astrocyten en microglia gebleken fagocytische rol spelen door Djaja synapsen4,5, apoptotic cellen8, neurale puin9en pathogene eiwitten, zoals bèta amyloid plaques10,11. In de ontwikkelende hersenen elimineren astrocyten synapsen in de dorsale laterale geniculate kern (dLGN) t/m4fagocytose MERTK – en MEGF10-afhankelijk. Evenzo, microglia ook elimineren C1q beklede synapsen tijdens ontwikkelingsstadia tot en met de klassieke complement cascade5. Interessant, is er gesuggereerd dat gebreken in de synaps snoeien kunnen bestaan uit een van de initiatiefnemers van verschillende neurologische stoornissen. Het heeft bijvoorbeeld aangetoond dat mutaties in aanvulling onderdeel 4 (C4), waardoor aanvulling-bemiddelde synapse snoeien door microglia, sterk geassocieerd met de prevalentie van schizofrenie in mens12 zijn. Een recent document heeft ook aangetoond dat de klassieke complement pathway hyperactivated in de stadia van de initiatie van AD is en vroege synapse verlies in deze ziekte13induceert.
Vergeleken met microglia-gemedieerde fagocytose, is of Astrocyt-gemedieerde fagocytose bijdraagt tot de inleiding en de progressie van verschillende neurologische aandoeningen minder duidelijk. Echter, een recente papier suggereert dat factoren die veranderen van het tempo van de normale synapse snoeien door astrocyten kunnen hersenen homeostase te verstoren en aan AD gevoeligheid en pathologie14 bijdragen. Het tempo van de synaps snoeien door astrocyten wordt krachtig gecontroleerd door ApoE isomeren, met een beschermende allel voor AD (ApoE2) sterk verbeteren van het tarief en de allel van een risico voor AD (ApoE4) aanzienlijk verlagen het tarief. Bovendien, transgene muizen uitdrukken ApoE4 verzameld veel meer synaptic C1q dan controle of ApoE2 muizen14. Deze gegevens duiden erop dat verminderde Astrocyt-gemedieerde fagocytose in de vroege AD hersenen veroorzaken de accumulatie van verouderend C1q beklede synapsen/synaptic puin dat aanvulling-bemiddelde microglial fagocytose activeert, rijden van de degeneratie van synaptic . De verminderde fagocytische capaciteit van astrocyten bij ApoE4 vervoerders kan ook bijdragen aan de ongecontroleerde accumulatie van bèta amyloid plaques in de hersenen die getroffen zijn door AD.
Daarnaast is gebleken dat gliale cellen in de hersenen Drosophila leeftijd hun fagocytische vermogen als gevolg van verminderde vertaling van Draper, een homolog van Megf10 die astrocyten gebruiken verliezen voor het phagocytosing van de synapsen. Herstel van Draper niveaus redde de fagocytische capaciteit van gliale cellen, die efficiënt beschadigde axonale puin in de leeftijd hersenen in vergelijkbare mate als die in de jonge hersenen gewist, die aangeeft dat veroudering-geïnduceerde veranderingen in de fagocytische capaciteit van astrocyten kunnen bijdragen aan een verstoring van de hersenen homeostase15.
Op basis van deze nieuwe bevindingen, moduleren van de fagocytische capaciteit van astrocyten mogelijk een aantrekkelijke therapeutische strategie ter preventie en behandeling van diverse neurologische aandoeningen. In dit verband zijn er verschillende pogingen ondernomen om het verbeteren van de fagocytische capaciteit van astrocyten, bijvoorbeeld door verzuring van lysosomen met zure nanodeeltjes16 inducerende en overexpressing van de transcriptiefactor EB (TFEB), die kan verbeteren lysosoom biogenese17. Ondanks deze pogingen is het nog onduidelijk hoe de astrocyten en microglial cellen in hun fagocytische kinetiek verschillen en of we moeten vergroten of hun fagocytische capaciteiten in de verschillende ziekten verkleinen.
In deze paper presenteren we een nieuwe in vitro assay voor het opsporen van de fagocytische capaciteit van astrocyten in real-time. De gegevens wijzen verschillende kinetiek van engulfment en aantasting van astrocyten en microglia. Astrocyt-geconditioneerd medium (ACM), dat secreted factoren van astrocyten bevat, is essentieel voor effectieve fagocytose van astrocyten zowel microglia. Bovendien, Megf10, een fagocytische receptor in astrocyten en een homolog van Ced-1 en Draper, speelt belangrijke rol in Astrocyt-gemedieerde fagocytose8,18.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dit artikel presenteren we methoden voor een langdurig wonen-imaging in vitro fagocytose assay met gezuiverde gliale cellen en pH-indicator-geconjugeerd synaptosomes. We tonen aan dat in vergelijking met microglia, astrocyten bezitten verschillende engulfment en afbraak capaciteit tijdens de fagocytose van synaptosomes. Bovendien, blijkt onze gegevens dat Astrocyt-uitgescheiden factoren, die een “passerelle” moleculen zoals MEGE8, GAS6 en eiwitten bevatten, essentieel voor de efficiënte PS-afhankelijke fagoc…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedanken Yeon-Joo Jung voor haar experimental support tijdens synaptosome zuivering en Jungjoo Park voor beelden van synaptosomes met PS blootstelling. Bovendien, danken wij alle leden in Chung’s laboratorium voor nuttige discussie. Dit werk werd gesteund door de National Research Foundation van Korea (NRF) subsidie gefinancierd door de Koreaanse overheid (MSIP) (NRF-2016M3C7A1905391 en NRF-2016R1C1B3006969) (W.-S. C).
Materials
| Synaptosome purification | |||
| Percoll | GE healthcare life sciences | 17-0891-01 | |
| Quick Start Bradford Protein Assay Kit 2 | BIO-RAD | 5000202 | |
| pH indicator conjugation | |||
| Dimethyl sulfoxide(DMSO) | LPS solution | DMSO100 | |
| pHrodo red, succinimidyl ester | Molecula probes | P36600 | |
| Immunopanning | |||
| 10X Earle’s balanced salt solution (EBSS) | Sigma | E7510 | |
| Bovine serum albumin | Bovogen | BSA025 | |
| Deoxyrebonuclease 1 (DNase) | Worthington | Is002007 | |
| (DMEM) | Gibco | 11960-044 | |
| (dPBS) | Welgene | LB001-02 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 16000-044 | |
| Griffonia Simplicifolia Lectin(BSL-1) | Vector Labs | L-1100 | |
| Goat anti-mouse IgG+IgM(H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-005-044 | |
| Goat anti-mouse IgM (μ-chain) | Jackson ImmunoResearch | 115-005-020 | |
| Heparin-binding epidermal growth factor | Sigma | E4643 | |
| Human HepaCAM antibody | R&D systems | MAB4108 | |
| Integrin beta 5 monoclonal antibody (KN52) | eBioscience | 14-0497-82 | |
| L-cysteine | Sigma | C7880 | |
| L-glutamate | Gibco | 25030-081 | |
| N-acetly-L-cyteine (NAC) | Sigma | A8199 | |
| Neurobasal media | Gibco | 21103-049 | |
| O4 hybridoma supernatant(mouse IgM) | Bansal et al.23 | ||
| Papain | Worthington | Is003126 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Pluristrainer 20 μm | PluriSelect | 43-50020-03 | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P6407 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Putrescine dihydrochloride | Sigma | P5780 | |
| Purified rat anti-mouse CD45 | BD Pharmingen | 550539 | |
| Purified mouse anti-rat CD45 | BD Pharmingen | 554875 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| Transferrin | Sigma | T1147 | |
| Trypsin | Sigma | T9935 | |
| Trypsin inhibitor | Worthington | LS003086 | |
| Ultra-clear tube (Tube, Thinwall, Ultra-Clear) | Beckman Coulter | 344059 | |
| Collect IP-ACM | |||
| Macrosep Advance Centrifugal Devices with Omega Membrane (10k) | PALL | MAP010C37 | |
| Macrosep Advance Centrifugal Devices with Omega Membrane (30k) | PALL | MAP030C37 | |
| Phagocytosis live imaging assay | |||
| Juli stage | NanoEntek | ||
| Time Series Analyzer V3 plugins | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/time-series.html |
References
- Singh, S. K., et al. Astrocytes Assemble Thalamocortical Synapses by Bridging NRX1alpha and NL1 via Hevin. Cell. 164 (1-2), 183-196 (2016).
- Allen, N. J., et al. Astrocyte glypicans 4 and 6 promote formation of excitatory synapses via GluA1 AMPA receptors. Nature. 486 (7403), 410-414 (2012).
- Xu, J., Xiao, N., Xia, J. Thrombospondin 1 accelerates synaptogenesis in hippocampal neurons through neuroligin 1. Nat Neurosci. 13 (1), 22-24 (2010).
- Chung, W. S., et al. Astrocytes mediate synapse elimination through MEGF10 and MERTK pathways. Nature. 504 (7480), 394-400 (2013).
- Schafer, D. P., et al. Microglia sculpt postnatal neural circuits in an activity and complement-dependent manner. Neuron. 74 (4), 691-705 (2012).
- Ma, Z., Stork, T., Bergles, D. E., Freeman, M. R. Neuromodulators signal through astrocytes to alter neural circuit activity and behaviour. Nature. 539 (7629), 428-432 (2016).
- Parkhurst, C. N., et al. Microglia promote learning-dependent synapse formation through brain-derived neurotrophic factor. Cell. 155 (7), 1596-1609 (2013).
- Iram, T., et al. Megf10 Is a Receptor for C1Q That Mediates Clearance of Apoptotic Cells by Astrocytes. J Neurosci. 36 (19), 5185-5192 (2016).
- Tasdemir-Yilmaz, O. E., Freeman, M. R. Astrocytes engage unique molecular programs to engulf pruned neuronal debris from distinct subsets of neurons. Genes Dev. 28 (1), 20-33 (2014).
- Jones, R. S., Minogue, A. M., Connor, T. J., Lynch, M. A. Amyloid-beta-induced astrocytic phagocytosis is mediated by CD36, CD47 and RAGE. J Neuroimmune Pharmacol. 8 (1), 301-311 (2013).
- Wang, Y., et al. TREM2 lipid sensing sustains the microglial response in an Alzheimer’s disease model. Cell. 160 (6), 1061-1071 (2015).
- Sekar, A., et al. Schizophrenia risk from complex variation of complement component 4. Nature. 530 (7589), 177-183 (2016).
- Hong, S., et al. Complement and microglia mediate early synapse loss in Alzheimer mouse models. Science. 352 (6286), 712-716 (2016).
- Chung, W. S., et al. Novel allele-dependent role for APOE in controlling the rate of synapse pruning by astrocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (36), 10186-10191 (2016).
- Purice, M. D., Speese, S. D., Logan, M. A. Delayed glial clearance of degenerating axons in aged Drosophila is due to reduced PI3K/Draper activity. Nat Commun. 7, 12871 (2016).
- Loov, C., Mitchell, C. H., Simonsson, M., Erlandsson, A. Slow degradation in phagocytic astrocytes can be enhanced by lysosomal acidification. Glia. , (2015).
- Xiao, Q., et al. Enhancing astrocytic lysosome biogenesis facilitates Abeta clearance and attenuates amyloid plaque pathogenesis. J Neurosci. 34 (29), 9607-9620 (2014).
- Lu, T. Y., et al. Axon degeneration induces glial responses through Draper-TRAF4-JNK signalling. Nat Commun. 8, 14355 (2017).
- Dunkley, P. R., Jarvie, P. E., Robinson, P. J. A rapid Percoll gradient procedure for preparation of synaptosomes. Nat Protoc. 3 (11), 1718-1728 (2008).
- Stigliani, S., et al. Glia re-sealed particles freshly prepared from adult rat brain are competent for exocytotic release of glutamate. J Neurochem. 96 (3), 656-668 (2006).
- Foo, L. C., et al. Development of a method for the purification and culture of rodent astrocytes. Neuron. 71 (5), 799-811 (2011).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), (2012).
- Cahoy, J. D., et al. A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function. J Neurosci. 28 (1), 264-278 (2008).
