소설 체 외에 라이브 이미징 분석 결과의 사이토 중재 먹어서 사용 하 여 pH 지시자 활용 Synaptosomes
Summary
이 프로토콜 생체 외에서 라이브 이미징 먹어서 분석 결과 이다 phagocytic 용량의 측정을 제공 합니다. Microglia 및 순화 된 쥐 이다 pH 지시자 활용 된 synaptosomes 함께 사용 됩니다. 이 방법은 실시간 engulfment과 저하 속도 검색할 수 있습니다 하 고 사이토 식 균 작용을 조절 하는 요소를 식별 하는 적합 한 심사 플랫폼을 제공 합니다.
Abstract
이다 두뇌에 있는 주요한 세포 유형 고 시 냅 스 및 혈관에 직접 문의. Microglial 세포는 주요 면역 세포와 뇌의 식 세포만 간주 되었습니다, 하지만 최근의 연구 이다 또한 개발 시 냅 스 제거 등의 다양 한 phagocytic 프로세스에 참여 Alzheimer의 질병 (광고)에서 베타 아 밀 로이드 플 라크. 이러한 결과도 불구 하 고 사이토 engulfment의 효율성 및 그들의 목표의 명확 하지 않다 microglia의와 비교. 정보의이 부족 있는 사이토 microglia 중재 먹어서의 활동은 쉽게 비교 분석 결과 시스템의 부족 때문에 주로 이다. 이 목표를 달성 하기 위해 장기 생체 외에서 라이브 이미징 먹어서 분석 결과 순화 이다와 microglia phagocytic 용량 평가를 개발 했습니다. 이 분석 결과에 engulfment과 저하의 실시간 탐지 표시기 활용 된 synaptosomes, 리소좀과 같은 산 성 세포에 밝은 적색 형광을 방출 하는 pH를 사용 하 여 가능 하다. 우리의 새로운 분석 결과 라이브 영상 통해 식 균 작용의 간단 하 고 효과적인 검색을 제공합니다. 또한, 화학 물질 및 향상 시킬 수 또는 이다의 phagocytic 용량을 억제 하는 화합물을 식별 하이 체 외에서 먹어서 분석 결과 심사 플랫폼으로 사용할 수 있습니다. 화학 물질 및 화합물 glial 세포의 phagocytic 용량을 조절 하는 다양 한 치료에 도움이 될 것으로 시 냅 스 가지 치기 오작동 및 병원 성 단백질 축적 정신 장애 또는 신경 퇴행 성 질환 원인 표시 되었습니다. 신경 장애입니다.
Introduction
두뇌에 고르기가 아닌 셀 참조, glial 세포 중앙 신경 시스템 (CNS)에 주요 셀 유형입니다. 이전, glial 세포는 시 냅 스 속성과 기저 신경 생존 유지에 수동 역할 주로 단순한 지원 세포로 간주 되었다. 그러나, glial 세포 신경 생물학, 뇌 항상성, 중재 시 냅 스 형성1,2,3 , 시 냅 스를 유지 하는 등의 다양 한 측면에서 보다 적극적인 역할을 재생할 계시는 증거를 신흥 제거4,5, 그리고 변조 시 냅 스가 소성6,7. CNS에서 glial 세포는 이다, microglia, 및 oligodendrocytes 포함 됩니다. 이러한 세포, 이다와 microglia 보였다 시 냅 스4,5, apoptotic 세포8, 신경 파편9, 그리고 병원 성 단백질, 녹말 체 beta 등을 덮어 여 phagocytic 역할을 플 라크10,11. 개발 두뇌에서 이다 MERTK 및 MEGF10 종속 먹어서4등 측면 geniculate 핵 (dLGN)에서 시 냅 스를 제거합니다. 마찬가지로, microglia 또한 C1q 코팅 시 냅 스 클래식 보완 캐스케이드5발달 단계를 제거 합니다. 흥미롭게도, 그것은 결함 시 냅 스의 가지 치기에 여러 가지 신경 장애의 시작자 중 하나 될 수 있습니다 제안 되었습니다. 예를 들어 돌연변이 보완 구성 요소 4에서에서 (C4) microglia에 의해 보완-중재 시 냅 스의 가지 치기를 증가 인간12정신 분열 증의 보급에 강하게 연관 표시 되었습니다. 최근 종이 고아 한 보충 통로 hyperactivated 광고의 개시 단계에 하 고13이 질병에서 초기 냅 손실 유도도 표시 됩니다.
먹어서 microglia 중재와 비교, 덜 분명 하다 사이토 중재 먹어서 개시와 다양 한 신경 질환의 진행에 기여 하는 여부. 그러나, 최근 종이 이다 하 여 정상적인 시 냅 스 가지 치기의 속도 변경 하는 수 있습니다 두뇌 항상성 방해 요인과 광고 민감성과 병리학14을 나왔다. ApoE 이 성체, 광고 (ApoE2)에 대 한 보호 대립 유전자와 강하게 향상 속도 위험 대립 유전자 (ApoE4) 광고에 대 한 속도 크게 낮추는 이다에 의해 시 냅 스 가지 치기의 속도 강력 하 게 제어 됩니다. 또한, 유전자 변형 마우스 ApoE4 표현 제어 또는 ApoE2 마우스14보다 훨씬 더 많은 시 냅 스 C1q 축적. 이러한 데이터는 초기에 사이토 중재 먹어서 장애인 제안 광고 두뇌 활성화 보완-중재 microglial 먹어서, 시 냅 스 변성 운전 노화 C1q 코팅 시 냅 스/시 냅 스 파편의 축적을 유발 수 있습니다 . ApoE4 운반대에 이다의 장애인된 phagocytic 용량 또한 광고 영향을 두뇌에 베타 아 밀 로이드 플 라크의 통제 축적에 기여할 수 있습니다.
또한, 그것은 세 초파리 뇌에 glial 세포 드레이퍼, Megf10 이다 phagocytosing 시 냅 스를 사용 하는의 체의 감소 번역으로 인해 그들의 phagocytic 용량을 잃게 표시 되었습니다. 효율적으로 비슷한 정도 젊은 뇌를 노화 유도 나타내는 세 뇌에 손상된 axonal 파편 삭제 glial 세포의 phagocytic 용량 구조 드레이퍼 수준을 회복의 phagocytic 용량 변경 이다 두뇌 항상성15의 파괴에 기여할 수 있습니다.
이러한 새로운 발견을 바탕으로, 이다의 phagocytic 용량 변조 수 방지 하 고 다양 한 신경 질환을 치료 하는 매력적인 치료 전략. 이와 관련, 산 성 나노16 리소좀의 산성화를 유발 및 녹음 방송 요인 EB (TFEB), 향상 시킬 수 있는 overexpressing 이다, 예를 들어의 phagocytic 능력을 향상 시키는 몇 가지 시도 되었습니다. 리소좀 속17. 이러한 시도도 불구 하 고 그것은 여전히 확실치있지 않습니다 어떻게 이다 및 microglial 셀 phagocytic 그들의 활동에 다 우리가 해야 증가 여부 등 다양 한 질병에 그들의 phagocytic 용량 감소.
이 논문에서는, 소설 체 외에서 분석 결과 실시간으로 이다의 phagocytic 용량을 탐지 하기 위한 선물이. 데이터 이다에 microglia engulfment과 저하의 다른 활동을 보여줍니다. 사이토 조절 매체 (ACM), 포함 이다에서 분 비 요인, 이다와 microglia의 효과적인 먹어서 필수적입니다. 또한, Megf10, 이다에 Ced-1 과 드레이퍼, 체 phagocytic 수용 체 중재 하는 사이토 먹어서8,18에 중요 한 역할을 재생 합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 문서에서 우리는 장기 생체 외에서 라이브 이미징 먹어서 분석 결과 정제 glial 세포 및 pH 지시자 활용 된 synaptosomes를 사용 하 여 위한 방법을 제시. 우리 microglia와 비교 하는 표시 이다 synaptosomes의 식 균 작용 동안 다른 engulfment 저하 용량을가지고. 또한, 우리의 데이터 사이토 분 비 요인, GAS6, 단백질, 및 MEGE8 같은 브리징 분자를 포함 하는 두뇌에 있는 glial 세포의 효율적인 PS 종속 먹어서…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자 감사 연-주 정 그녀의 실험적인 지원에 대 한 synaptosome 정화와 Jungjoo 공원 동안 PS 노출 synaptosomes의 이미지. 또한, 우리는 유용한 토론에 대 한 정의 실험실에서 모든 회원을 감사합니다. 이 작품은 한국 정부 (MSIP) (NRF 2016M3C7A1905391와 NRF-2016R1C1B3006969)에 의해 투자 하는 한국 (NRF) 부여의 국립 연구 재단에 의해 지원 되었다 (W. S. C)입니다.
Materials
| Synaptosome purification | |||
| Percoll | GE healthcare life sciences | 17-0891-01 | |
| Quick Start Bradford Protein Assay Kit 2 | BIO-RAD | 5000202 | |
| pH indicator conjugation | |||
| Dimethyl sulfoxide(DMSO) | LPS solution | DMSO100 | |
| pHrodo red, succinimidyl ester | Molecula probes | P36600 | |
| Immunopanning | |||
| 10X Earle’s balanced salt solution (EBSS) | Sigma | E7510 | |
| Bovine serum albumin | Bovogen | BSA025 | |
| Deoxyrebonuclease 1 (DNase) | Worthington | Is002007 | |
| (DMEM) | Gibco | 11960-044 | |
| (dPBS) | Welgene | LB001-02 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 16000-044 | |
| Griffonia Simplicifolia Lectin(BSL-1) | Vector Labs | L-1100 | |
| Goat anti-mouse IgG+IgM(H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-005-044 | |
| Goat anti-mouse IgM (μ-chain) | Jackson ImmunoResearch | 115-005-020 | |
| Heparin-binding epidermal growth factor | Sigma | E4643 | |
| Human HepaCAM antibody | R&D systems | MAB4108 | |
| Integrin beta 5 monoclonal antibody (KN52) | eBioscience | 14-0497-82 | |
| L-cysteine | Sigma | C7880 | |
| L-glutamate | Gibco | 25030-081 | |
| N-acetly-L-cyteine (NAC) | Sigma | A8199 | |
| Neurobasal media | Gibco | 21103-049 | |
| O4 hybridoma supernatant(mouse IgM) | Bansal et al.23 | ||
| Papain | Worthington | Is003126 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Pluristrainer 20 μm | PluriSelect | 43-50020-03 | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P6407 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Putrescine dihydrochloride | Sigma | P5780 | |
| Purified rat anti-mouse CD45 | BD Pharmingen | 550539 | |
| Purified mouse anti-rat CD45 | BD Pharmingen | 554875 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| Transferrin | Sigma | T1147 | |
| Trypsin | Sigma | T9935 | |
| Trypsin inhibitor | Worthington | LS003086 | |
| Ultra-clear tube (Tube, Thinwall, Ultra-Clear) | Beckman Coulter | 344059 | |
| Collect IP-ACM | |||
| Macrosep Advance Centrifugal Devices with Omega Membrane (10k) | PALL | MAP010C37 | |
| Macrosep Advance Centrifugal Devices with Omega Membrane (30k) | PALL | MAP030C37 | |
| Phagocytosis live imaging assay | |||
| Juli stage | NanoEntek | ||
| Time Series Analyzer V3 plugins | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/time-series.html |
References
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