En roman I Vitro Live bildebehandling analysen av astrocytter-mediert fagocytose bruker pH indikator-konjugerte Synaptosomes
Summary
Denne protokollen presenterer en i vitro live bildebehandling fagocytose analysen for å måle astrocyttene phagocytic kapasitet. Renset rotte astrocyttene og microglia brukes sammen med pH indikator-konjugerte synaptosomes. Denne metoden kan oppdage sanntid engulfment og fornedrelse kinetics og gir en passende screening plattform for å identifisere faktorer modulerende astrocytter fagocytose.
Abstract
Astrocyttene er den store celle i hjernen og direkte kontakt synapser og blodkar. Selv om microglial celler har blitt vurdert av store immunceller og bare phagocytes i hjernen, har nyere studier vist at astrocyttene også delta i ulike phagocytic prosesser, for eksempel utviklingsmessige synapse eliminering og rydding av amyloid beta plaketter i Alzheimers sykdom (AD). Disse funnene er effektiviteten av astrocytter engulfment og nedbrytning av deres mål uklart forhold til microglia. Denne mangelen på informasjon er hovedsakelig på grunn av mangel på et analysen system som the kinetics av astrocytter – og microglia-mediert fagocytose er lett sammenlignbare. For å oppnå dette målet, har vi utviklet en langsiktig live bildebehandling i vitro fagocytose analysen for å evaluere phagocytic kapasitet på renset astrocyttene og microglia. I denne analysen er sanntids deteksjon av engulfment og fornedrelse mulig med pH indikator-konjugerte synaptosomes, som avgir lys rød fluorescens i surt organeller, som lysosomer. Våre romanen analysen gir enkel og effektiv deteksjon av fagocytose gjennom live bildebehandling. I tillegg kan denne i vitro fagocytose analysen brukes som en screening plattform for å identifisere kjemikalier og forbindelser som kan forbedre eller hemme astrocyttene phagocytic kapasitet. Som synaptic beskjæring feil og patogene protein akkumulering har vist seg å forårsake psykiske lidelser eller nevrodegenerative sykdommer, bør kjemikalier og forbindelser som modulerer phagocytic kapasitet gliacellene være nyttig i behandling av ulike nevrologiske lidelser.
Introduction
Gliacellene, som refererer til ikke-nervøs cellene i hjernen, er den store celle i sentralnervesystemet (CNS). Tidligere ble gliacellene betraktet som bare støtter celler som hovedsakelig spille passiv roller i å opprettholde nevronale overlevelse og basale synaptic egenskaper. Imidlertid har nye bevis avslørt at gliacellene spille mer aktive roller i ulike aspekter av Surgery, som vedlikeholder hjernen homeostase, formidling synapse formasjon1,2,3 og synapse eliminering4,5og modulerende synaptiske plastisitet6,7. Gliacellene i CNS inkluderer astrocyttene, microglia og oligodendrocytes. Blant disse cellene, astrocyttene og microglia har vist seg å spille phagocytic roller av engulfing synapser4,5, apoptotisk celler8, neural rusk9og patogene proteiner, for eksempel amyloid beta plaketter10,11. Utvikle hjernen eliminere astrocyttene synapser i dorsal lateral geniculate kjernen (dLGN) til MERTK – og MEGF10-avhengige fagocytose4. Tilsvarende microglia også eliminere C1q-belagt synapser under utviklingsstadier gjennom klassiske supplement gjennomgripende5. Interessant, har det blitt antydet at feil i synapse beskjæring kan være en av initiativtakerne til flere nevrologiske lidelser. For eksempel har det vært vist at mutasjoner i komplement komponent 4 (C4), noe som øker komplement-mediert synapse beskjæring av microglia, er sterkt assosiert med utbredelsen av schizofreni mennesker12. En fersk papir har også vist at den klassiske komplementbanen er hyperactivated i initiering av Annonsen og induserer tidlig synapse tap i denne sykdommen13.
Sammenlignet med microglia-mediert fagocytose, er om astrocytter-mediert fagocytose bidrar til innvielse og progresjon av ulike nevrologiske lidelser mindre klart. En fersk papir antyder imidlertid at faktorer som endrer frekvensen av normal synapse beskjæring av astrocyttene kan forstyrre hjernen homeostase, og bidra til AD mottakelighet og patologi14. Frekvensen av synapse beskjæring av astrocyttene kontrollert kraftfullt av ApoE isomerene, med en beskyttende allelet for Annonsen (ApoE2) sterkt forbedrer hastigheten og en risiko allelet for Annonsen (ApoE4) betydelig redusere hastigheten. Videre, samlet transgene mus uttrykke ApoE4 mye mer synaptic C1q enn kontroll eller ApoE2 mus14. Disse data tyder på at svekket astrocytter-mediert fagocytose tidlig AD hjernen kan føre til opphopning av senescent C1q-belagt synapser/synaptic rusk som aktiverer komplement-mediert microglial fagocytose, kjører synaptic degenerasjon . Nedsatt phagocytic kapasitet astrocyttene i ApoE4 operatører kan også bidra til ukontrollert akkumulering av amyloid beta plaketter i AD-berørte hjernen.
I tillegg har det vært vist at gliacellene i alderen Drosophila hjernen mister sine phagocytic kapasitet på grunn av redusert oversettelse av Draper, en homolog av Megf10 astrocyttene bruker for phagocytosing synapser. Gjenopprette Draper nivåer reddet phagocytic kapasitet gliacellene, effektivt klarert skadet axonal rusk i alderen hjernen i samme grad som i unge hjernen, indikerer at aldring-indusert endringer i phagocytic kapasitet astrocyttene kan bidra til avbrudd i hjernen homeostase15.
Basert på disse nye resultatene, kan modulerende phagocytic kapasitet astrocyttene være en attraktiv terapeutiske strategi for å forebygge og behandle ulike nevrologiske lidelser. I denne forbindelse har det vært flere forsøk på å forbedre phagocytic kapasitet astrocyttene, for eksempel ved inducing forsuring av lysosomer med surt nanopartikler16 og overexpressing transkripsjon faktor EB (TFEB), som forbedrer lysosome biogenesis17. Til tross for disse forsøkene er det fortsatt uklart hvordan astrocyttene og microglial forskjellige sine phagocytic kinetics og om vi skal øke eller redusere sine phagocytic kapasitet i ulike sykdommer.
I dette papiret presenterer vi en roman i vitro analysen for å oppdage den phagocytic kapasiteten av astrocyttene i sanntid. Dataene viser forskjellige kinetics av engulfment og fornedrelse i astrocyttene og microglia. Astrocytter-conditioned medium (ACM), som inneholder utskilles faktorer fra astrocyttene, er avgjørende for effektiv fagocytose astrocyttene og microglia. Videre spiller Megf10, en phagocytic reseptor astrocyttene og en homolog av Ced-1 og Draper, viktige roller i astrocytter-mediert fagocytose8,18.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne artikkelen presenterer vi metoder for en langsiktig live bildebehandling i vitro fagocytose analysen renset gliacellene og pH indikator-konjugerte synaptosomes. Vi viser at sammenlignet med microglia, astrocyttene har ulike engulfment og fornedrelse kapasitet under fagocytose av synaptosomes. I tillegg tyder våre data på at astrocytter-utskilles faktorer, som inneholder bygge bro molekyler som GAS6, proteiner og MEGE8, er avgjørende for effektiv PS-avhengige fagocytose av gliacellene i hjernen. Videre…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker Yeon-Joo Jung for hennes eksperimentell støtte under synaptosome rensing og Jungjoo Park for bilder av synaptosomes med PS eksponering. Dessuten, takker vi alle medlemmer i Chung laboratorium for nyttig diskusjon. Dette arbeidet ble støttet av National Research Foundation av Korea (NRF) stipend finansiert av koreanske myndigheter (MSIP) (NRF-2016M3C7A1905391 og NRF-2016R1C1B3006969) (W.-S. C).
Materials
| Synaptosome purification | |||
| Percoll | GE healthcare life sciences | 17-0891-01 | |
| Quick Start Bradford Protein Assay Kit 2 | BIO-RAD | 5000202 | |
| pH indicator conjugation | |||
| Dimethyl sulfoxide(DMSO) | LPS solution | DMSO100 | |
| pHrodo red, succinimidyl ester | Molecula probes | P36600 | |
| Immunopanning | |||
| 10X Earle’s balanced salt solution (EBSS) | Sigma | E7510 | |
| Bovine serum albumin | Bovogen | BSA025 | |
| Deoxyrebonuclease 1 (DNase) | Worthington | Is002007 | |
| (DMEM) | Gibco | 11960-044 | |
| (dPBS) | Welgene | LB001-02 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 16000-044 | |
| Griffonia Simplicifolia Lectin(BSL-1) | Vector Labs | L-1100 | |
| Goat anti-mouse IgG+IgM(H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-005-044 | |
| Goat anti-mouse IgM (μ-chain) | Jackson ImmunoResearch | 115-005-020 | |
| Heparin-binding epidermal growth factor | Sigma | E4643 | |
| Human HepaCAM antibody | R&D systems | MAB4108 | |
| Integrin beta 5 monoclonal antibody (KN52) | eBioscience | 14-0497-82 | |
| L-cysteine | Sigma | C7880 | |
| L-glutamate | Gibco | 25030-081 | |
| N-acetly-L-cyteine (NAC) | Sigma | A8199 | |
| Neurobasal media | Gibco | 21103-049 | |
| O4 hybridoma supernatant(mouse IgM) | Bansal et al.23 | ||
| Papain | Worthington | Is003126 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Pluristrainer 20 μm | PluriSelect | 43-50020-03 | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P6407 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Putrescine dihydrochloride | Sigma | P5780 | |
| Purified rat anti-mouse CD45 | BD Pharmingen | 550539 | |
| Purified mouse anti-rat CD45 | BD Pharmingen | 554875 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| Transferrin | Sigma | T1147 | |
| Trypsin | Sigma | T9935 | |
| Trypsin inhibitor | Worthington | LS003086 | |
| Ultra-clear tube (Tube, Thinwall, Ultra-Clear) | Beckman Coulter | 344059 | |
| Collect IP-ACM | |||
| Macrosep Advance Centrifugal Devices with Omega Membrane (10k) | PALL | MAP010C37 | |
| Macrosep Advance Centrifugal Devices with Omega Membrane (30k) | PALL | MAP030C37 | |
| Phagocytosis live imaging assay | |||
| Juli stage | NanoEntek | ||
| Time Series Analyzer V3 plugins | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/time-series.html |
References
- Singh, S. K., et al. Astrocytes Assemble Thalamocortical Synapses by Bridging NRX1alpha and NL1 via Hevin. Cell. 164 (1-2), 183-196 (2016).
- Allen, N. J., et al. Astrocyte glypicans 4 and 6 promote formation of excitatory synapses via GluA1 AMPA receptors. Nature. 486 (7403), 410-414 (2012).
- Xu, J., Xiao, N., Xia, J. Thrombospondin 1 accelerates synaptogenesis in hippocampal neurons through neuroligin 1. Nat Neurosci. 13 (1), 22-24 (2010).
- Chung, W. S., et al. Astrocytes mediate synapse elimination through MEGF10 and MERTK pathways. Nature. 504 (7480), 394-400 (2013).
- Schafer, D. P., et al. Microglia sculpt postnatal neural circuits in an activity and complement-dependent manner. Neuron. 74 (4), 691-705 (2012).
- Ma, Z., Stork, T., Bergles, D. E., Freeman, M. R. Neuromodulators signal through astrocytes to alter neural circuit activity and behaviour. Nature. 539 (7629), 428-432 (2016).
- Parkhurst, C. N., et al. Microglia promote learning-dependent synapse formation through brain-derived neurotrophic factor. Cell. 155 (7), 1596-1609 (2013).
- Iram, T., et al. Megf10 Is a Receptor for C1Q That Mediates Clearance of Apoptotic Cells by Astrocytes. J Neurosci. 36 (19), 5185-5192 (2016).
- Tasdemir-Yilmaz, O. E., Freeman, M. R. Astrocytes engage unique molecular programs to engulf pruned neuronal debris from distinct subsets of neurons. Genes Dev. 28 (1), 20-33 (2014).
- Jones, R. S., Minogue, A. M., Connor, T. J., Lynch, M. A. Amyloid-beta-induced astrocytic phagocytosis is mediated by CD36, CD47 and RAGE. J Neuroimmune Pharmacol. 8 (1), 301-311 (2013).
- Wang, Y., et al. TREM2 lipid sensing sustains the microglial response in an Alzheimer’s disease model. Cell. 160 (6), 1061-1071 (2015).
- Sekar, A., et al. Schizophrenia risk from complex variation of complement component 4. Nature. 530 (7589), 177-183 (2016).
- Hong, S., et al. Complement and microglia mediate early synapse loss in Alzheimer mouse models. Science. 352 (6286), 712-716 (2016).
- Chung, W. S., et al. Novel allele-dependent role for APOE in controlling the rate of synapse pruning by astrocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (36), 10186-10191 (2016).
- Purice, M. D., Speese, S. D., Logan, M. A. Delayed glial clearance of degenerating axons in aged Drosophila is due to reduced PI3K/Draper activity. Nat Commun. 7, 12871 (2016).
- Loov, C., Mitchell, C. H., Simonsson, M., Erlandsson, A. Slow degradation in phagocytic astrocytes can be enhanced by lysosomal acidification. Glia. , (2015).
- Xiao, Q., et al. Enhancing astrocytic lysosome biogenesis facilitates Abeta clearance and attenuates amyloid plaque pathogenesis. J Neurosci. 34 (29), 9607-9620 (2014).
- Lu, T. Y., et al. Axon degeneration induces glial responses through Draper-TRAF4-JNK signalling. Nat Commun. 8, 14355 (2017).
- Dunkley, P. R., Jarvie, P. E., Robinson, P. J. A rapid Percoll gradient procedure for preparation of synaptosomes. Nat Protoc. 3 (11), 1718-1728 (2008).
- Stigliani, S., et al. Glia re-sealed particles freshly prepared from adult rat brain are competent for exocytotic release of glutamate. J Neurochem. 96 (3), 656-668 (2006).
- Foo, L. C., et al. Development of a method for the purification and culture of rodent astrocytes. Neuron. 71 (5), 799-811 (2011).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), (2012).
- Cahoy, J. D., et al. A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function. J Neurosci. 28 (1), 264-278 (2008).
