Photoactivatable 激动剂对 T 细胞活化的时空控制
Summary
该协议描述了一种基于成像的方法, 激活 t 淋巴细胞使用 photoactivatable 肽 MHC, 使精确的时空控制 t 细胞活化。
Abstract
T 淋巴细胞参与快速, 极化信号, 发生在几分钟后 TCR 激活。这诱发了免疫突触的形成, 一种定型的细胞间结, 调节 T 细胞活化和定向靶效应反应。为了有效地研究这些过程, 需要一种适合捕获快速、极化响应的成像方法。该协议描述了这样一个系统, 它是基于 photoactivatable 肽-主要的组织相容性复合物 (抵押贷款公司), 它是不刺激的, 直到它暴露在紫外线。该试剂的靶 decaging 在 videomicroscopy 实验中, 通过全内反射 (TIRF) 成像, 实现对 TCR 活化和对后续细胞反应的高分辨率监测的精确时空控制。这种方法也符合遗传和药理的摄动策略。这允许组装明确定义的分子通路, 将 TCR 信号与免疫突触的极化骨架结构的形成联系起来。
Introduction
t 淋巴细胞 (t 细胞) 通过识别细胞表面 MHC 的抗原肽, 在细胞免疫中起重要作用。抗原识别是由 TCR 介导的, 它驱动了幼稚 T 细胞的分化, 促进了溶细胞的传递, 并推动了效应人群的交际反应。TCR 的参与也诱发了细胞结构的戏剧性变化。在几分钟内, T 细胞 gloms 到抗原呈现细胞 (APC) 的一侧, 形成一个极化接口, 称为免疫突触 (是)1,2。增强 t 细胞效应反应通过使细胞因子的定向释放, 或者, 在细胞毒性 T 淋巴细胞 (CTLs), 裂解蛋白, 破坏 APC。
TCR 参与抵押贷款公司诱导了多个下游适配器分子的快速磷酸化, 包括连接器的活化 T 细胞 (LAT), 这最终促进强健的重塑突触细胞骨架2。皮质丝状肌动蛋白 (F 肌动蛋白) 驱动 T 细胞传播在 APC 表面, 然后解决成环状结构的特点是 F 肌动蛋白积累在外围和耗尽从中心。F-肌动蛋白环形成紧密耦合到重新定位微管组织中心 (MTOC, 也称为中心体在 T 细胞) 到一个位置只是在界面的中心。这两种事件都发生在初始抗原识别的几分钟内, 并建立了随后激活事件和效应响应发生的体系结构上下文。
研究的是形成, 各种实验室已经开发的方法, 其中 APC 被一个玻璃表面取代, 其中包括固定化 TCR 配体或支持脂双层, 本身包含配体3,4。t 细胞形成类似的接触在这些表面上, 可以通过全内反射荧光显微镜 (TIRF) 或共聚焦显微成像, 使高分辨率研究早期 T 细胞活化和形成。
虽然这些方法已经允许充分组装的优秀可视化是, 许多信号跟随 TCR: 抵押贷款公司结扎发生在几秒钟之内, 复杂化努力确定事件序列在 TCR 活化以后准确地.为了规避此问题, 开发了一种 photoactivation 方法, 其中 photoactivatable 抵押贷款公司用于实现 TCR激活5、6、7的时空控制.在这一系统中, T 细胞附着在含有 photoactivatable 抵押贷款公司的玻璃表面上, 而非刺激 TCR 直到紫外线 (UV) 光照射。在 t 细胞下的微米尺寸区域的紫外线照射会使 photocage 产生一个可由 t 细胞识别的刺激区。随后的信号事件和骨架重塑, 然后监测使用基因编码荧光记者。两个 photoactivatable 版本的抗原肽, 蛾细胞色素 c88-103 (MCC) 和卵清蛋白257-264 (卵), 这是在第二类 mhc I-Ek和类 I mhc H2-Kb分别提出, 已已开发 (图 1)。这样, 就可以对 CD4k中特定的+ T 单元格进行分析 (表示5C。C7、2B4 或 TCRs) 和 CD8 OVA-H2-Kb (表示 OT1 TCR) 的+ T 单元格。
在过去的十年中, TCR photoactivation 和成像方法已被用来建立早期 TCR 信号步骤的精确动力学, 并确定的分子路径控制极化骨架重塑5,6,7,8,9,10. 例如, 这项化验有助于确定中心体转向 APC 的方向是由甘油中心的脂质第二信使的局部梯度介导的。预计这种方法将继续对要求高分辨率的 T 细胞功能成像分析的应用有价值。
Protocol
Representative Results
Discussion
近年来, 光已成为 spatiotemporally 控制激活细胞过程的绝佳工具。开发了各种方法, 各有关联的优缺点。这里描述的系统, 这是基于 decaging 的固定化, 胞外配体, 是非常适合分析快速, 亚细胞, 极化信号响应。这种方法已被应用于检测 T 细胞的形成, 如上文所述。此外, 其他受体的笼型配体已被设计, 使我们能够应用同样的策略来评估自然杀伤细胞中的抑制信号和转录因子 NF-nf-κb 的核易位, 以回应像受体…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢下院实验室的成员提供咨询和协助。得到美国国立卫生研究院 (R01-AI087644 M.H. 和 P30-CA008748 的支持, 纪念斯隆-凯特林癌症中心)。
Materials
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass | Thermofischer Scientific | 155361 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P2636 | Will need to make Biotinylated Poly-L-Lysine |
| EZ-Link NHS-Biotin | Thermofischer Scientific | 20217 | Will need to make Biotinylated Poly-L-Lysine |
| Streptavidin | Thermofischer Scientific | 434301 | |
| BirA-500: BirA biotin-protein ligase standard reaction kit | Avidity | BirA500 | Will be used to biotinylate proteins |
| Biotinylated Hb I-EK | For protein folding, see reference 6. For biotinylation, use BirA kit | ||
| Biotinylated NPE-MCC I-EK | Anaspec | Custom NPE-MCC (H-ANERADLIAYL-K(Nvoc)-QATK-OH) can be purchased from Anaspec | |
| Biotinylated αH2-Kk antibody | BD Biosciences | 553591 | |
| Biotinylated NPE-OVA H2-Kb | Anaspec | Custom NPE-OVA (H-SIINFE-K(Nvoc)-L-OH) can be purchased from Anaspec | |
| Biotinylated KAVY H2-Db | Anaspec | Custom synthesized protein (KAVYDFATL) can be purchased from Anaspec | |
| Biotinylated ICAM1 | For protein folding, see reference in protocol. For biotinylation, use BirA kit | ||
| Hand held UV lamp | UVP | UVGL-25 | Lamp is held < 1 cm from the sample. 30 s of 365 light is sufficient for detectable decaging, 20 min for quantitative decaging. |
| Olympus IX-81 OMAC TIRF system. | Olympus | Additional information about the imaging system can be found in Figure 6 | |
| Mosaic digital diaphragm | Andor | ||
| Slidebook software | Intelligent Imaging Innovations |
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