Ruimtelijke en temporele controle van T cel activatie met behulp van een Photoactivatable-Agonist
Summary
Dit protocol beschrijft een imaging gebaseerde methode om te activeren met behulp van photoactivatable peptide-MHC, waardoor nauwkeurige Spatio controle van T cel activatie van T-lymfocyten.
Abstract
T-lymfocyten zich bezighouden met het snelle, gepolariseerde signalering, die zich voordoen binnen enkele minuten na activering van de TCR. Dit induceert de vorming van de immunologische SYNAPS, een stereotiepe cel-cel-knooppunt dat regelt van T cel activatie en gerichte doelen effector reacties. Deze processen effectief studeren, is een imaging aanpak die is aangepast voor het vastleggen van snelle, gepolariseerde antwoorden nodig. Dit protocol beschrijft een dergelijk systeem, dat gebaseerd is op een photoactivatable peptide-major histocompatibility complex (pMHC) dat is niet-stimulerend totdat het wordt blootgesteld aan ultraviolet licht. Gerichte decaging van dit reagens tijdens videomicroscopy experimenten kan nauwkeurige Spatio controle van TCR activering en hoge resolutie controle van latere cellulaire reacties door de totale interne reflectie (TIRF) imaging. Deze aanpak is ook compatibel met genetische en farmacologische perturbation strategieën. Dit zorgt voor de vergadering van welomschreven moleculaire trajecten die link TCR signalering tot de vorming van de gepolariseerde cytoskeletal structuren die ten grondslag liggen aan de immunologische synaps.
Introduction
T-lymfocyten (T-cellen) spelen een centrale rol in de cellulaire immuniteit door de erkenning van de antigene peptiden in het kader van het celoppervlak MHC weergegeven. Antigeen erkenning, dat is bemiddeld door de TCR, drijft de differentiatie van naïeve T cellen en bevordert de levering van de cytolytische en communicatieve antwoorden van effector populaties. TCR betrokkenheid induceert ook dramatische veranderingen in cellulaire architectuur. Binnen enkele minuten de T-cellen gloms op de kant van de antigeen-presenteren cel (APC), vormen een gepolariseerde interface genoemd de immunologische synapse (IS)1,2. Het IS potentiates T cel effector reacties doordat de directionele release van cytokines of, in het geval van cytotoxische T-lymfocyten (CTL’s), lytische eiwitten die de APC vernietigen.
TCR betrokkenheid door pMHC induceert de snelle fosforylatie van meerdere stroomafwaartse adapter moleculen, met inbegrip van de Linker voor de activering van T-cellen (LAT), die uiteindelijk bevordert robuuste remodelleren van de synaptische cytoskelet2. Corticale filamenteuze actine (F-actine) T cel verspreiden over het oppervlak van de APC-stations, en vervolgens moet omzetten naar een ringvormige structuur gekenmerkt door ophoping van de F-actine onderaan de IS periferie en de uitputting van het centrum. F-actine ring vorming is het strak gekoppeld aan de heroriëntering van het organiserende centrum van microtubuli (MTOC, ook wel de centrosoom in T-cellen) naar een positie net onder het midden van de interface. Beide gebeurtenissen zich voordoen binnen enkele minuten van de eerste antigeen erkenning en stellen de architecturale context waarin de activering van de daaropvolgende gebeurtenissen en effector reacties optreden.
Studeren IS vorming, hebben verschillende labs benaderingen waarbij de APC is vervangen door een glazen oppervlak, dat geïmmobiliseerdet TCR liganden bevat of ondersteunt een lipide dubbelgelaagde dat zelf de liganden3,4 bevatontwikkeld. T-cellen vormen IS-achtige contacten op deze oppervlakken die image kunnen worden gemaakt door de totale interne reflectie fluorescentie Microscoop (TIRF) of confocale microscopie, waardoor hoge resolutie studies van vroege T-cel activatie en IS vorming.
Hoewel deze benaderingen hebben toegestaan voor uitstekende visualisatie van het volledig geassembleerde IS, plaatsvindt veel van de signalering volgende TCR:pMHC afbinding binnen seconden, complicerende inspanningen om te bepalen van de volgorde van de gebeurtenissen na de activering van de TCR nauwkeurig . Om dit probleem te omzeilen, een photoactivation aanpak ontwikkeld, waarin photoactivatable pMHC wordt gebruikt om spatio controle over TCR activering5,6,7. In dit systeem, zijn T-cellen gekoppeld aan glazen oppervlakken met photoactivatable pMHC thats niet-stimulerend voor de TCR totdat bestraald met ultraviolet (UV) licht. UV bestraling van een regio van de micron grootte van het oppervlak onder de T cel verwijdert het creëren van een stimulerend zone die kan worden herkend door de T-cel photocage. Daaropvolgende signalering gebeurtenissen en cytoskeletal remodeling worden vervolgens gecontroleerd met behulp van genetisch gecodeerde fluorescerende verslaggevers. Twee versies van de photoactivatable van antigene peptides, nachtvlinder cytochroom c88-103 (MCC) en ovoalbumine257-264 (OVA), die worden gepresenteerd in het kader van de klasse II MHC-Ek en de klasse ik MHC H2-Kb, respectievelijk, zijn geweest ontwikkeld (Figuur 1). Dit maakt de analyse van beide CD4+ T cellen specifiek voor MCC-ik-Ek (uiting van de 5 C. C7, 2B4, of en TCRs) en CD8+ T cellen specifiek voor eicellen-H2-Kb (uiten de OT1 TCR).
In het afgelopen decennium, is de TCR photoactivation en imaging aanpak gebruikt om de precieze kinetiek van vroege TCR signalering stappen, en ook om te identificeren van de moleculaire pathways bestuur gepolariseerde cytoskeletal remodelleert5, 6 , 7 , 8 , 9 , 10. de bepaling was bijvoorbeeld instrumentaal bij het bepalen van die centrosoom heroriëntatie naar de APC wordt gemedieerd door een gelokaliseerde verloop van het lipide tweede boodschapper diacylglycerol gecentreerd op de IS. Verwacht wordt dat deze methode zal waardevol zijn voor toepassingen die hoge resolutie beeldvormende analyse van T-cel functie vereisen.
Protocol
Representative Results
Discussion
In de afgelopen jaren heeft licht ontpopt als een uitstekend hulpmiddel voor spatiotemporally gecontroleerde activering van cellulaire processen. Verschillende methoden zijn ontwikkeld, elk met de bijbehorende voordelen en nadelen. Het systeem hier beschreven, die is gebaseerd op de decaging van geïmmobiliseerdet, extracellulaire ligand, is bij uitstek geschikt voor de analyse van snelle, subcellular, gepolariseerde signalering reacties. Deze aanpak is vereffend te onderzoeken IS vorming in T cellen zoals hierboven besc…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken de leden van de lab Huse voor advies en hulp. Ondersteund door de Amerikaanse National Institutes of Health (R01-AI087644 naar M.H.) en P30-CA008748 aan Memorial Sloan-Kettering Cancer Center.
Materials
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass | Thermofischer Scientific | 155361 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P2636 | Will need to make Biotinylated Poly-L-Lysine |
| EZ-Link NHS-Biotin | Thermofischer Scientific | 20217 | Will need to make Biotinylated Poly-L-Lysine |
| Streptavidin | Thermofischer Scientific | 434301 | |
| BirA-500: BirA biotin-protein ligase standard reaction kit | Avidity | BirA500 | Will be used to biotinylate proteins |
| Biotinylated Hb I-EK | For protein folding, see reference 6. For biotinylation, use BirA kit | ||
| Biotinylated NPE-MCC I-EK | Anaspec | Custom NPE-MCC (H-ANERADLIAYL-K(Nvoc)-QATK-OH) can be purchased from Anaspec | |
| Biotinylated αH2-Kk antibody | BD Biosciences | 553591 | |
| Biotinylated NPE-OVA H2-Kb | Anaspec | Custom NPE-OVA (H-SIINFE-K(Nvoc)-L-OH) can be purchased from Anaspec | |
| Biotinylated KAVY H2-Db | Anaspec | Custom synthesized protein (KAVYDFATL) can be purchased from Anaspec | |
| Biotinylated ICAM1 | For protein folding, see reference in protocol. For biotinylation, use BirA kit | ||
| Hand held UV lamp | UVP | UVGL-25 | Lamp is held < 1 cm from the sample. 30 s of 365 light is sufficient for detectable decaging, 20 min for quantitative decaging. |
| Olympus IX-81 OMAC TIRF system. | Olympus | Additional information about the imaging system can be found in Figure 6 | |
| Mosaic digital diaphragm | Andor | ||
| Slidebook software | Intelligent Imaging Innovations |
References
- Dustin, M. L., Chakraborty, A. K., Shaw, A. S. Understanding the structure and function of the immunological synapse. Cold Spring Harb.Perspect.Biol. 2, a002311 (2010).
- Liu, X., Huse, M. Immunological Synapse Formation: Cell Polarity During T Cell-APC Interaction. Cell Polarity 1. , 247-275 (2015).
- Bunnell, S. C., Kapoor, V., Trible, R. P., Zhang, W., Samelson, L. E. Dynamic actin polymerization drives T cell receptor-induced spreading: A role for the signal transduction adaptor LAT. Immunity. 14, 315-329 (2001).
- Dustin, M. Insights into Function of the Immunological Synapse from Studies with Supported Planar Bilayers. Current topics in microbiology and immunology. 340, (2010).
- Chauveau, A., Le Floc’h, A., Bantilan, N. S., Koretzky, G. a., Huse, M. Diacylglycerol kinase α establishes T cell polarity by shaping diacylglycerol accumulation at the immunological synapse. Sci. Signal. 7, ra82 (2014).
- Huse, M., et al. Spatial and Temporal Dynamics of T Cell Receptor Signaling with a Photoactivatable Agonist. Immunity. 27, 76-88 (2007).
- Quann, E. J., Merino, E., Furuta, T., Huse, M. Localized diacylglycerol drives the polarization of the microtubule-organizing center in T cells. Nat Immunol. 10, 627-635 (2009).
- Basu, R., Chen, Y., Quann, E. J., Huse, M. The variable hinge region of novel PKCs determines localization to distinct regions of the immunological synapse. PLoS One. 9, 1-8 (2014).
- Liu, X., Kapoor, T. M., Chen, J. K., Huse, M. Diacylglycerol promotes centrosome polarization in T cells via reciprocal localization of dynein and myosin II. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 11976-11981 (2013).
- Quann, E. J., Liu, X., Altan-Bonnet, G., Huse, M. A cascade of protein kinase C isozymes promotes cytoskeletal polarization in T cells. Nat. Immunol. 12, 647-654 (2011).
- Boniface, J. J., Reich, Z., Lyons, D. S., Davis, M. M. Thermodynamics of T cell receptor binding to peptide-MHC: evidence for a general mechanism of molecular scanning. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 11446-11451 (1999).
- Garboczi, D. N., Hung, D. T., Wiley, D. C. HLA-A2-peptide complexes: refolding and crystallization of molecules expressed in Escherichia coli and complexed with single antigenic peptides. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89, 3429-3433 (1992).
- Huse, M., Lillemeier, B. F., Kuhns, M. S., Chen, D. S., Davis, M. M. T cells use two directionally distinct pathways for cytokine secretion. Nat. Immunol. 7, 247-255 (2006).
- Abeyweera, T. P., Merino, E., Huse, M. Inhibitory signaling blocks activating receptor clustering and induces cytoskeletal retraction in natural killer cells. J. Cell Biol. 192, 675-690 (2011).
- Nguyen Duc, T., Huse, M. A Generalizable Platform for the Photoactivation of Cell Surface Receptors. ACS Chem. Biol. 10, 2435-2440 (2015).
- Airan, R. D., Thompson, K. R., Fenno, L. E., Bernstein, H., Deisseroth, K. Temporally precise in vivo control of intracellular signalling. Nature. 458, 1025-1029 (2009).
- Xu, Y., et al. Optogenetic control of chemokine receptor signal and T-cell migration. Proc. Natl. Acad. Sci. 111, 6371-6376 (2014).
- Levskaya, A., Weiner, O. D., Lim, W. A., Voigt, C. A. Spatiotemporal control of cell signalling using a light-switchable protein interaction. Nature. 461, 997-1001 (2009).
- Guntas, G., et al. Engineering an improved light-induced dimer (iLID) for controlling the localization and activity of signaling proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. 112, 112-117 (2015).
- Wu, Y. I., et al. A genetically encoded photoactivatable Rac controls the motility of living cells. Nature. 461, 104-108 (2009).
- Pathak, G. P., Vrana, J. D., Tucker, C. L. Optogenetic control of cell function using engineered photoreceptors. Biol. cell/under auspices Eur. Cell Biol. Organ. 105, 59-72 (2014).
- Grusch, M., et al. Spatio-temporally precise activation of engineered receptor tyrosine kinases by light. EMBO J. 33, 1713-1726 (2014).
- Yi, J., et al. Centrosome repositioning in T cells is biphasic and driven by microtubule end-on capture-shrinkage. J. Cell Biol. 202, 779-792 (2013).
