Indagando i dannosi effetti di basso pressione sterilizzazione al Plasma sulla sopravvivenza di Bacillus subtilis spore utilizzando Live Cell microscopia
Summary
Questo protocollo illustra i passaggi consecutivi importanti necessari per valutare la pertinenza di monitoraggio parametri di vitalità e processi di riparazione del DNA nel rilancio di spore di Bacillus subtilis dopo il trattamento con plasma a bassa pressione di rilevamento proteine tramite microscopia confocale risolta in tempo e microscopia elettronica di esame di riparazione del DNA marcato con fluorescenza.
Abstract
Sterilizzazione al plasma è una promettente alternativa ai metodi di sterilizzazione convenzionali per industriali, clinici e fini di volo spaziale. Bassa pressione del plasma (LPP) scarichi contengono un ampio spettro di specie attive, che portare alla rapida inattivazione microbica. Per studiare i meccanismi di sterilizzazione di LPP ed efficienza, usiamo spore di Bacillus subtilis il microrganismo da testare a causa della loro straordinaria resistenza contro procedure di sterilizzazione convenzionali. Descriviamo la produzione di monostrati di spore di Bacillus subtilis , il processo di sterilizzazione di plasma a bassa pressione in un doppio reattore al plasma accoppiato induttivamente, la caratterizzazione della morfologia di spore mediante microscopia elettronica a scansione (SEM) e la analisi di germinazione e di conseguenza di spore per microscopia di cellule vive. Il principale obiettivo della specie del plasma è materiale genomico (DNA) e riparazione di lesioni al DNA plasma-indotta con il ritorno di spora è cruciale per la sopravvivenza dell’organismo. Qui, studiamo la capacità di germinazione delle spore e il ruolo del DNA di riparazione durante la germinazione delle spore e la conseguenza dopo il trattamento con LPP di rilevamento delle proteine di riparazione di fluorescente etichettati DNA (RecA) con microscopia di fluorescenza confocale risolta nel tempo. Trattati e strati monomolecolari della spora non trattati sono attivati per la germinazione e visualizzati con un microscopio invertito confocale cellule vive nel tempo di seguire la reazione di spore individuali. Le nostre osservazioni rivelano che la frazione di germinazione e superando le spore dipende la durata del LPP-trattamento raggiungendo un minimo dopo 120 s. RecA-YFP fluorescenza (proteina di fluorescenza giallo) è stato rilevato soltanto in poche spore e sviluppato in tutte le superando le cellule con una leggera elevazione in spore LPP-trattati. Inoltre, alcuni dei batteri vegetativi derivato da spore LPP-trattati hanno mostrate un aumento nel citoplasma e tendeva a lyse. I metodi descritti per l’analisi delle singole spore potrebbero essere esemplari per lo studio di altri aspetti della germinazione delle spore e la conseguenza.
Introduction
Degli obiettivi principali dell’esplorazione dello spazio è la ricerca per le firme di forme di vita e biomolecole su altri corpi planetari e lune nel nostro sistema solare. Il trasferimento di microrganismi o di biomolecole di origine terrestre nelle zone critiche di esplorazione è di particolare rischio per influenzare lo sviluppo e l’integrità delle missioni di vita-rilevazione sui corpi planetari ad esempio Marte ed Europa1. Le linee guida internazionali di protezione planetaria, fondata da comitato di ricerca spaziale (COSPAR) nel 1967, imporre norme rigorose sulle missioni con equipaggiati e robotiche per altri pianeti, le lune, asteroidi e altri corpi celesti e regolano la pulizia e sterilizzazione di un veicolo spaziale e componenti hardware critici prima di lanciare al fine di eliminare contaminanti microrganismi terrestri ed evitare la contaminazione incrociata di corpi celesti2. Nell’ultimo decennio, l’applicazione dei plasmi termici ha guadagnato ampia attenzione nella ricerca biomedica e nutrizionale, così come nel volo spaziale applicazioni3,4,5. Sterilizzazione al plasma è una promettente alternativa ai metodi di sterilizzazione convenzionali in quanto offre rapida ed efficace inattivazione microbica6, pur essendo delicato sensibili e materiali labili al calore. Gli scarichi del plasma contengono una miscela di agenti reattivi come i radicali liberi, particelle cariche, atomi neutri/eccitato, fotoni nell’ultravioletto (UV) e dello spettro ultravioletto vuoto (VUV) che portano alla rapida inattivazione microbica3. In questo studio, usiamo il plasma a bassa pressione generato dal doppio plasma accoppiato induttivamente a bassa pressione (DICP) fonte7,8 per inattivare le endospore di Bacillus subtilis distribuiti sulla superficie di prova di vetro.
Batteri Gram-positivi della famiglia Bacillaceae sono ampiamente distribuiti in habitat naturali del suolo, sedimenti e aria così come in ambienti insoliti come in camera pulita e la stazione spaziale internazionale9,10 ,11. La caratteristica più distinta del genere Bacillus è la capacità di formare endospores dormienti altamente resistente (in appresso denominato “spore”) per sopravvivere in condizioni sfavorevoli, ad esempio svuotamento nutriente12. Le spore sono generalmente molto più resistenti rispetto ai loro omologhi di cellula vegetativa per una varietà di trattamenti e stress ambientali, tra cui calore, UV, raggi gamma, essiccazione, rottura meccanica e prodotti chimici tossici, quali forti ossidanti o pH-cambiando agenti (recensiti in riferimenti13,14) e sono quindi gli oggetti ideali per verificare l’efficienza dei metodi di inattivazione microbica. Poiché il DNA di genomic è il principale bersaglio del trattamento al plasma dei batteri15,16, la riparazione di lesioni del DNA indotte da plasma (es. doppio filamento di DNA si rompe) su Spora revival è cruciale per la sopravvivenza di batteri13, 17.
Quindi, studiamo la capacità di germinazione delle spore e il ruolo della riparazione del DNA durante la germinazione delle spore e la conseguenza dopo aver trattato le spore con plasma a bassa pressione dell’argon di seguenti spore individuali e riparare loro espressione di DNA marcato con fluorescenza proteina RecA con microscopia di fluorescenza confocale risolta nel tempo. Noi diamo una passo per passo le istruzioni del preparato di Bacillus subtilis spore negli strati monomolecolari per il raggiungimento di risultati di test riproducibili, il trattamento di monostrati di spora con plasma a bassa pressione per la sterilizzazione, la preparazione delle spore del plasma trattato per la valutazione ultrastrutturale mediante microscopia elettronica a scansione (SEM) e microscopia di tensione delle cellule a livello di singoli spore in concerto con il DNA attivo di monitoraggio processi che avvengono all’interno della cellula in risposta al trattamento al plasma di riparazione.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sterilizzazione di superfici con bassa temperatura, plasma a bassa pressione è una promettente alternativa alle procedure di sterilizzazione piuttosto convenzionali come il trattamento con radiazioni ionizzanti radiazioni, sostanze chimiche (ad es. gas come H2O2 o ossido di etilene) o calore secco e umido23. Metodi di sterilizzazione ordinaria principalmente forniscono un’efficace sterilizzazione, ma essi sono noti per influenzare il materiale trattato e rappresenta…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano Andrea Schröder per la sua eccellente assistenza tecnica durante le parti di questo lavoro e Nikea J. Ulrich per la sua assistenza durante le riprese video. Vorremmo anche ringraziare Lyle A. Simmons per la sua generosa donazione dei ceppi di Bacillus subtilis : LAS72 e LAS24. Questo lavoro è stato supportato in parti da sovvenzioni dalla Fondazione di ricerca tedesca (DFG) Paketantrag (PlasmaDecon PAK 728) a PA (AW 7/3-1) e RM (MO 2023/2-1) e DLR concedere DLR-FuW-Projekt ISS vita, Programm RF-FuW, Teilprogramm 475 (a Giulio, M.R. e R.M.). F.M.F. è stata sostenuta da una borsa di studio di dottorato di ricerca dell’Helmholtz spazio Life Sciences Research School (SpaceLife) presso il centro aerospaziale tedesco (DLR) a Colonia, in Germania, che è stato finanziato dall’Associazione Helmholtz (Helmholtz-Gemeinschaft) per un periodo di sei anni ( Grant No. VH-Ko-300) e ha ricevuto fondi supplementari da DLR, tra cui il Comitato esecutivo aerospaziale e l’Istituto di medicina aerospaziale. I risultati di questo studio saranno tra la tesi di dottorato di Felix M. Fuchs.
Materials
| Two substance nozzle (model 970-8) | Schlick | 14,404 | 230 V, 50 Hz, D 4.484/8, 0.8 mm bore diameter |
| Luria Bertani Medium | Sigma Aldrich | 70122-100G | |
| Tube connectors | Festo | n/a | G 1/8 |
| Magnetvalve DO35-3/2NC-G018-230AC | Bosch Rexroth | 820005100 | |
| PLN Polyamid tube | Festo | 558206 | d = 6 mm |
| Glass slides | VWR | 48300-026 | |
| Electric Timer 550-2-C | Gefran | F000074 | 220 V |
| attofluor cell chamber | Menzel, Fisher Ref. | 3406816 | d=25 mm, round |
| MgSO4*7 H2O | Sigma Aldrich | 13152 | |
| Ca(NO3)2 | Sigma Aldrich | 202967 | |
| MnCl2 * 4 H2O | Sigma Aldrich | 244589 | |
| FeSO4 * 7H2O | AppliChem | 13446-34-9 | |
| Glucose | Merck | 215422 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P9541-500G | |
| Nutrient Broth (NB) | Merck | 105443 | |
| Luria-Bertani (LB) | Merck | 110283 | |
| 96-wellplate | ThermoFisher | 243656 | |
| Zeiss LSM 780, Axio Observer Z1 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | n/a | |
| Leo 1530 Gemini | Carl Zeiss Microscopy GmbH | n/a | |
| ZEN 2 and ZEN lite 2012 (Software) | Carl Zeiss Microscopy GmbH | n/a | |
| SigmaPlot, version 13.0 (Statistic software) | Systat GmbH, Erkrath, Germany | n/a | |
| Attofluor cell chamber | Invitrogen | A7816 | |
| µ-Dish 35 mm, high Grid-500 Glass Bottom | ibidi | 81168 |
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