Investigar los efectos perjudiciales de baja presión Plasma esterilización sobre la supervivencia de vivir el Bacillus subtilis esporas usando el celular microscopia
Summary
Este protocolo ilustra los pasos consecutivos importantes requeridos para evaluar la importancia del monitoreo de parámetros de vitalidad y procesos de reparación del ADN en la reactivación de las esporas de Bacillus subtilis después del tratamiento con plasma de baja presión por seguimiento proteínas a través del tiempo-resolved de la microscopia confocal y microscopía electrónica de barrido de reparación del ADN marcado con fluorescencia.
Abstract
Esterilización de plasma es una alternativa prometedora a métodos convencionales de esterilización industrial, clínico, y vuelos espaciales. Descargas de plasma (LPP) de baja presión contienen un amplio espectro de especies activas, que conducen a la rápida inactivación microbiana. Para estudiar la eficacia y los mecanismos de esterilización por LPP, utilizamos las esporas del organismo prueba Bacillus subtilis debido a su extraordinaria resistencia contra procedimientos de esterilización convencionales. Se describe la producción de monocapas de esporas B. subtilis , el proceso de esterilización por plasma de baja presión en un reactor de plasma inductivamente acoplado doble, la caracterización de la morfología de la espora mediante microscopía electrónica (SEM) y la Análisis de germinación y consecuencia de esporas por microscopía de células vivas. Un objetivo importante de especies de plasma es material genómico (DNA) y la reparación de lesiones de DNA inducida por plasma al renacimiento de la espora es crucial para la supervivencia del organismo. Aquí, estudiamos la capacidad de germinación de las esporas y el papel de ADN reparación durante la germinación de las esporas y consecuencia después del tratamiento con LPP por seguimiento marcado con fluorescencia ADN reparación proteínas (RecA) con microscopía de fluorescencia confocal tiempo resuelto. Tratados y monocapas de espora sin tratar son activadas para la germinación y visualizarse con un microscopio confocal invertido vivo de la célula con el tiempo a seguir la reacción de esporas individuales. Nuestras observaciones revelan que la fracción de germinación y rebasar las esporas depende de la duración del tratamiento de LPP llegando a un mínimo después de 120 s. RecA-YFP (proteína de la fluorescencia amarilla) fluorescencia fue detectada solamente en algunas esporas y desarrollada en todas rebasar las células con una elevación leve de las esporas tratadas con LPP. Por otra parte, algunas de las bacterias vegetativas derivan de esporas LPP tratados mostraron un aumento en el citoplasma y tendían a lyse. Los métodos descritos para el análisis de esporas individuales podrían ser ejemplares para el estudio de otros aspectos de la germinación de las esporas y consecuencia.
Introduction
Una meta importante de la exploración espacial es la búsqueda de firmas de las formas de vida y biomoléculas en otros cuerpos planetarios y lunas de nuestro sistema solar. La transferencia de microorganismos o biomoléculas de origen terrestre a las áreas críticas de exploración es de particular riesgo para impactar el desarrollo y la integridad de las misiones de detección de vida en cuerpos planetarios como Marte y Europa1. Las normas internacionales de protección planetaria, establecida por el Comité de investigaciones espaciales (COSPAR) en 1967, imponer regulaciones estrictas en misiones tripuladas y robóticas a otros planetas, sus lunas, asteroides y otros cuerpos celestes y regular la limpieza y esterilización de una nave espacial y componentes de hardware crítico previo para poner en marcha con el fin de eliminar contaminantes microorganismos terrestres y evitar la contaminación cruzada de los cuerpos celestes2. En la última década, la aplicación de plasma no térmico ha ganado gran atención en la investigación biomédica y nutricional, así como en vuelos espaciales tripulados aplicaciones3,4,5. Esterilización de plasma es una alternativa prometedora distinta a los métodos convencionales de esterilización ya que ofrece rápido y eficaz de inactivación microbiana6, mientras que siendo suave para sensibles y materiales lábiles al calor. Descargas de plasma contienen una mezcla de agentes reactivas como los radicales libres, partículas cargadas, neutral/excitado átomos, fotones de la radiación ultravioleta (UV) y el espectro de vacío ultravioleta (VUV) que conducen a la rápida inactivación microbiana3. En este estudio, utilizamos plasma de baja presión generada por la doble fuente de plasma acoplado inductivamente de baja presión (fenotipo)7,8 para inactivar las endosporas de Bacillus subtilis distribuidas en la superficie de ensayo de vidrio.
Bacterias Gram-positivas de la familia Bacillaceae están ampliamente distribuidas en hábitats naturales de suelo, sedimentos y aire, así como en ambientes inusuales tales como instalaciones de sala limpia y la estación espacial internacional9,10 ,11. La característica más distintiva del género Bacillus es la capacidad para formar endosporas latentes muy resistentes (en lo sucesivo como esporas) para sobrevivir condiciones desfavorables, tales como agotamiento de nutrientes12. Las esporas son generalmente mucho más resistentes que sus homólogos de la célula vegetativa a una variedad de tratamientos y de presiones ambientales, incluyendo calor, UV, radiación gamma, desecación, perturbaciones mecánicas y productos químicos tóxicos, tales como oxidantes fuertes o agentes de cambio de pH (revisados en referencias13,14) y por lo tanto, son objetos ideales para probar la eficacia de los métodos de inactivación microbiana. Puesto que el ADN genómico es un objetivo importante del tratamiento plasma de bacterias15,16, la reparación de las lesiones de DNA inducida por plasma (por ejemplo, rompe la doble cadena de ADN) en esporas avivamiento es crucial para la supervivencia de las bacterias13, 17.
Así, estudiamos la capacidad de germinación de las esporas y el papel de la reparación de la DNA durante la germinación de las esporas y consecuencia después de tratar las esporas con plasma de argón de baja presión por esporas individuales siguientes y reparar su expresión de ADN marcado con fluorescencia proteína RecA con microscopía de fluorescencia confocal tiempo resuelto. Le damos una instrucción paso a paso de la preparación de esporas B. subtilis en monocapas para lograr resultados reproducibles, el tratamiento de las monocapas de espora con plasma de baja presión para la esterilización, la preparación de plasma tratado esporas para evaluación ultraestructural mediante microscopía electrónica (SEM) y análisis de microscopía de células vivas en el nivel de esporas individuales en concierto con el monitoreo del ADN activado reparación de procesos que ocurren dentro de la célula en respuesta al tratamiento de plasma.
Protocol
Representative Results
Discussion
Esterilización de superficies con baja temperatura, baja presión de plasma es una alternativa prometedora distinta a los procedimientos de esterilización algo convencional como el tratamiento con radiaciones ionizantes radiación, productos químicos (por ejemplo, gases como el H2O2 o óxido de etileno) o calor seco y húmedo23. Métodos de esterilización normal sobre todo proporcionan una efectiva esterilización, pero se sabe que influyen en el material tratado…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen a Andrea Schröder por su excelente asistencia técnica durante las partes de este trabajo y Nikea J. Ulrich por su ayuda durante la sesión de video. También nos gustaría agradecer a Lyle A. Simmons por su generosa donación de las cepas de Bacillus subtilis : LAS72 y LAS24. Este trabajo fue financiado en partes por las subvenciones de la Fundación de investigación alemana (DFG) Paketantrag (PlasmaDecon PAK 728) a PA (AW, 7, 3-1) y RM (MO 2023/2-1) y el DLR conceden DLR-FuW-Projekt ISS vida, Programm RF-FuW, Teilprogramm 475 (a F.M.F, M.R. y R.M.). F.M.F.2001 fue apoyado por una beca de doctorado de la escuela de investigación de Ciencias de la vida de espacio Helmholtz (SpaceLife) en el Centro Aeroespacial Alemán (DLR) en Colonia, Alemania, que fue financiado por la Asociación de Helmholtz (Helmholtz-Gemeinschaft) durante un período de seis años ( Grant no. VH-Ko-300) y recibió fondos adicionales de la DLR, incluyendo Comité Ejecutivo aeroespacial y el Instituto de medicina aeroespacial. Los resultados de este estudio se incluirán en la tesis doctoral de Felix M. Fuchs.
Materials
| Two substance nozzle (model 970-8) | Schlick | 14,404 | 230 V, 50 Hz, D 4.484/8, 0.8 mm bore diameter |
| Luria Bertani Medium | Sigma Aldrich | 70122-100G | |
| Tube connectors | Festo | n/a | G 1/8 |
| Magnetvalve DO35-3/2NC-G018-230AC | Bosch Rexroth | 820005100 | |
| PLN Polyamid tube | Festo | 558206 | d = 6 mm |
| Glass slides | VWR | 48300-026 | |
| Electric Timer 550-2-C | Gefran | F000074 | 220 V |
| attofluor cell chamber | Menzel, Fisher Ref. | 3406816 | d=25 mm, round |
| MgSO4*7 H2O | Sigma Aldrich | 13152 | |
| Ca(NO3)2 | Sigma Aldrich | 202967 | |
| MnCl2 * 4 H2O | Sigma Aldrich | 244589 | |
| FeSO4 * 7H2O | AppliChem | 13446-34-9 | |
| Glucose | Merck | 215422 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P9541-500G | |
| Nutrient Broth (NB) | Merck | 105443 | |
| Luria-Bertani (LB) | Merck | 110283 | |
| 96-wellplate | ThermoFisher | 243656 | |
| Zeiss LSM 780, Axio Observer Z1 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | n/a | |
| Leo 1530 Gemini | Carl Zeiss Microscopy GmbH | n/a | |
| ZEN 2 and ZEN lite 2012 (Software) | Carl Zeiss Microscopy GmbH | n/a | |
| SigmaPlot, version 13.0 (Statistic software) | Systat GmbH, Erkrath, Germany | n/a | |
| Attofluor cell chamber | Invitrogen | A7816 | |
| µ-Dish 35 mm, high Grid-500 Glass Bottom | ibidi | 81168 |
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