Induisant la recombinaison Cre-lox dans le Cortex cérébral par l’intermédiaire de In Utero électroporation de souris

Katherine M. Bland; Zachary O. Casey; Christopher J. Handwerk; Z. Logan Holley; George S. Vidal

doi:10.3791/56675

Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.

Article de méthode

Induisant la recombinaison Cre-lox dans le Cortex cérébral par l’intermédiaire de In Utero électroporation de souris

11.8K vues

⸱

DOI :

10.3791/56675

⸱

17 novembre 2017

Katherine M. Bland^*¹ , Zachary O. Casey^*¹ , Christopher J. Handwerk^*¹ , Z. Logan Holley¹ , George S. Vidal¹

¹Department of Biology, James Madison University

^* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Cellule autonome fonction des gènes dans le cerveau peut être étudiées en induisant la perte ou gain de fonction dans des populations clairsemées de cellules. Nous décrivons ici dans l’utérus l’électroporation pour livrer une recombinase Cre en populations clairsemées de mettre au point des neurones corticaux avec floxed gènes à provoquer une perte de fonction in vivo.

Résumé

Les fonctions neuronales cellule autonome de gènes peuvent être révélées par une perte ou gain de fonction d’un gène dans une petite population clairsemée des neurones. Pour ce faire nécessite générant une mosaïque dans laquelle des neurones avec perte ou gain de fonction d’un gène sont entourés de tissu génétiquement non perturbé. Ici, nous combinons le système de recombinaison Cre-lox avec in utero électroporation afin de générer des tissus cérébraux de mosaïque qui peuvent être utilisé pour étudier la fonction cellule autonome de gènes dans les neurones. Constructions d’ADN (disponible par le biais de dépôts), codant pour une étiquette fluorescent et la recombinase Cre, sont introduits dans le développement des neurones corticaux contenant des gènes flanqués de sites loxP dans le cerveau d’embryons de souris à l’aide de in utero électroporation. En outre, les auteurs décrivent les diverses adaptations de la méthode d’électroporation in utero qui augmentent les chances de survie et de la reproductibilité. Cette méthode consiste aussi à établir un titre pour la recombinaison Cre-mediated dans une population clairsemée ou dense des neurones. Préparations histologiques du tissu cérébral marqués n’ont pas besoin (mais peut être adaptées à) l’immunohistochimie. Les constructions utilisées garantissent que fluorescent étiqueté neurones portent le gène de la recombinase Cre. Préparations histologiques permettent une analyse morphologique des neurones par le biais de l’imagerie confocale des arbres dendritiques et axonales et des épines dendritiques. Parce que perte ou gain de fonction est fournie dans les tissus de mosaïque éparse, cette méthode permet l’étude des cellules autonomes nécessité et la suffisance des produits de gène in vivo.

Introduction

Générant une mosaïque génétique est un paradigme expérimental classique pour comprendre la fonction d’un gène d’intérêt. Pour déterminer si un gène est nécessaire pour un phénotype cellulaire, l’approche la plus simple est à l’origine une perte de fonction du gène dans l’ensemble de l’organisme (p. ex. knockout). Toutefois, pour déterminer si un gène est nécessaire précisément dans un certain type de cellule, Knock-out du gène dans l’ensemble de l’organisme n’est pas une approche valable. Au lieu de cela, il faut une méthode qui causera la perte de fonction d’un gène dans une cellule donnée alors qu’il est entouré par le tissu de type sauvage (c'est-à-dir....