Construcción de una plataforma de proyección de alto rendimiento para evaluar la heterogeneidad de la amplificación del gen HER2 en cáncer de mama
Summary
Distribución heterogénea de células HER-2 positivo se puede observar en un subgrupo de cánceres de mama y genera dilemas clínicos. Aquí, presentamos un protocolo fiable y rentable para definir, cuantificar y comparar la heterogeneidad genética de la intra-tumor HER2 en una serie grande de los cánceres de mama heterogéneo procesados.
Abstract
Terapias dirigidas contra el receptor de factor de crecimiento epidérmico humano 2 (HER2) han cambiado radicalmente el resultado de pacientes con cáncer de mama positivo para HER2. Sin embargo, una minoría de casos muestra una distribución heterogénea de células HER-2 positivo, que genera grandes desafíos clínicos. Hasta la fecha, no hay protocolos confiables y estandarizados para la caracterización y cuantificación de la amplificación del gen HER2 heterogénea en grandes cohortes se han propuesto. Aquí, presentamos una metodología de alto rendimiento para evaluar simultáneamente el estado de HER2 en diferentes áreas topográficas de múltiples cánceres de mama. En particular, nos ilustran el procedimiento de laboratorio para la construcción de microarreglos de tejido mejorado (TMAs) incorporando una asignación específica de los tumores. Todos los parámetros de TMA se han optimizado específicamente para la plata en situ hibridación (SISH) de formalina-fijo parafina-encajado (FFPE) tejidos del pecho. El análisis de Immunohistochemical de los biomarcadores pronósticos y predictivos (es decir, ER, PR, Ki67 y HER2) debe realizarse mediante los procedimientos automatizados. Se ha implementado un protocolo personalizado de SISH para permitir un análisis molecular de alta calidad a través de múltiples tejidos que experimentaron diferentes procedimientos de fijación, procesamiento y almacenamiento. En este estudio, le ofrecemos una prueba de principio que secuencias específicas de ADN podrían ser cánceres localizados simultáneamente en distintas zonas topográficas de múltiple y heterogéneo procesados usando un método eficiente y rentable.
Introduction
HER2 es un proto-oncogene que se sobreexpresa y amplificado en 15-30% de todos cánceres de mama invasivo1,2. Sobreexpresión de HER2 se infiere por la presencia de > 10% células con membrana fuerte inmunohistoquímica (IHC) tinción (3 +), mientras que la amplificación del gen pueden ser evaluada cuando el número de copias del gen es ≥6, o el HER2/centrómero es ≥ 2 en el recuento en por lo menos 20 células por en situ hibridación (ISH)3.
Heterogeneidad genética intra-tumor ha sido ampliamente descrito en los cánceres de mama, siendo un colaborador potencialmente adverso para la evaluación de biomarcadores y tratamientos respuesta4. Según el Colegio de patólogos americanos (CAP), HER2 heterogeneidad existe si HER2 está amplificado en > 5% y < 50% del tumor de la infiltración de las células5. Lamentablemente, la incidencia real de la heterogeneidad espacial de HER2 en cáncer de mama sigue siendo un tema de controversia entre patólogos, con algunos autores mantienen es un evento extremadamente raro, y otros que sugieren que hasta un 40% de los casos son HER2-heterogénea1,5,6,7,8,9,10. A pesar de los mecanismos biológicos que sostienen esta condición no son todavía completamente aclarado, los impactos clínicos y pronósticos de la heterogeneidad de HER2 del tumor intra son cruciales para el de pacientes de cáncer de mama11.
Recientemente, técnicas moleculares de campo brillante, como ISH cromogénica (CISH) y ISH plata (SISH), han surgido como métodos confiables para detectar heterogeneidad de HER2 en los tejidos FFPE, con algunas ventajas en comparación con a fluorescente ISH (pescado)12. Lamentablemente, el análisis de a granel de casos individuales sigue siendo poco práctico en estudios de grandes cohortes. Varios grupos han sugerido que la combinación de histoquímica, IHC y ISH con tecnologías TMA podría representar una estrategia valiosa en el estudio de cáncer biología13,14,15,16. Con este método ampliamente adoptado, las muestras de tejido de diferentes pacientes pueden analizarse al mismo tiempo, minimizar el tejido y los reactivos empleados y así fomentar el análisis uniforme de una serie grande de casos14. Sin embargo, no hay protocolos están disponibles para la caracterización molecular simultánea de alto rendimiento de múltiples muestras de tejido que experimentó diferentes de procesamiento en cuanto a reactivos, fijación de tiempos y métodos de conservación empleados, tales como archivo bloques.
Dada las implicaciones clínicas y pronósticas de heterogeneidad espacial de HER2 en cáncer de mama, hemos desarrollado una plataforma integrada de molecular para evaluar en series grandes de casos procesados heterogéneo. Aquí, describen las estrategias de laboratorio para generar y analizar la heterogeneidad intra-tumor de amplificación de HER2 en TMAs de alto rendimiento de cáncer de mama por medio de SISH. El siguiente protocolo ha sido desarrollado para medir los tumores > 5 mm (> pT1b según el TNM 2017)17. Para lesiones más pequeñas, se recomienda realizar el análisis en las secciones seriales Full-Face. Nuestro procedimiento permite el análisis simultáneo de la IHC y SISH de hasta 30 cáncer de mama, que abarca una media de 6 zonas diferenciadas (rango 4-8) para cada caso. En conjunto, se generarán 180 núcleos de tejido de 1 mm de diámetro, con 500 μm entre los núcleos y de 2 mm entre la cuadrícula y los bordes de cada bloque TMA.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí, hemos detallado las estrategias de laboratorio para realizar análisis SISH del gene HER2 y su centrómero correspondiente en TMAs de alto rendimiento de cánceres de mama heterogéneo procesados. Este método es rentable y puede llevarse a cabo en la mayoría de los laboratorios para el estudio de la heterogeneidad de amplificación del gen HER2 en cohortes grandes de los archivos de patología de mama cáncer obtenido forma.
Debido a la importancia clínica de HER2 e…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ninguno.
Materials
| Surgipath Paraplast | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU | 39601006 | Tissue embedding medium, 56 °C melting point |
| Eosin Y 1% water solution | Bio Optica, Milan, Italy, EU | 510002 | Eosin yellowish, water-soluble |
| Carazzi’s hematoxylin | Bio Optica, Milan, Italy, EU | 506012 | Alum hematoxylin ripened using potassium iodate |
| Diamond quality | Laboindustria, Arzergrande, Italy, EU | 33533 | 26×76 mm microscope slides |
| Leica CV Mount | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU | 14046430011 | Mounting medium, with no monomers, based on polymers of butylmethacrylate in xylene |
| FLEX IHC microscope slides | Agilent Technologies (Dako), Santa Clara, CA, USA | K8020 | Coated microscope slides for adhesion of FFPE for use in IHC |
| BenchMark ULTRA | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | N750-BMKU-FS | Slide staining system |
| CONFIRM anti-Estrogen Receptor (ER) (SP1) Rabbit Monoclonal Primary Antibody | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 790-4324 | Primary antibody, ready-to-use |
| CONFIRM anti-Progesterone Receptor (PR) (1E2) Rabbit Monoclonal Primary Antibody | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 790-2223 | Primary antibody, ready-to-use |
| CONFIRM anti-Ki-67 (30-9) Rabbit Monoclonal Primary Antibody | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 790-4286 | Primary antibody, ready-to-use |
| PATHWAY HER2 (4B5) Rabbit Monoclonal Primary Antibody | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 790-4493 | Primary antibody, ready-to-use |
| ultraView Universal DAB Detection Kit | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 760-500 | Indirect, biotin-free system for detecting mouse IgG, mouse IgM and rabbit primary antibodies |
| INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 780-4422 | INFORM HER2 Dual ISH assay – Dual color in situ hybridization FDA approved automated assay for determining HER2 gene status in breast cancer patients |
| ultraView Silver ISH DNP Detection Kit | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 800-098 | |
| ultraView Red ISH DIG Detection Kit | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 800-505 | |
| ISH Protease 3 | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 780-4149 | Used in the ISH process to remove protein that surrounds the target DNA sequences of interest |
| Hematoxylin | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 760-2021 | Modified Gill's hematoxylin counterstain reagent |
| Hematoxylin II Counterstaining | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 790-2208 | Modified Meyer's hematoxylin counterstain reagent |
| Bluing reagent | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 760-2037 | Aqueous solution of buffered lithium carbonate for bluing hematoxylin stained sections on glass slides |
| HybReady | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 780-4409 | Formamide-based buffer for ISH assays |
| EZ Prep (10x) | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 950-102 | Concentrate solution for paraffin removal from tissue samples during IHC and ISH reactions, and to dilute 1:10. |
| SSC Buffer (10X) | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 950-110 | Sodium Chloride Sodium Citrate buffer solution is used for stringency washes and to rinse slides between staining steps and provide a stable aqueous environment for the in situ hybridization reactions. Dilute 1:5. |
| ULTRA LCS | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 650-210 | Prediluted (ready-to-use) coverslip solution used as a barrier between the aqueous reagents and the air to prevent evaporation in the IHC and ISH reactions |
| Reaction Buffer (10x) | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 950-300 | Tris based buffer solution (pH 7.6 ± 0.2) to rinse slides between staining steps during IHC and ISH. Dilute 1:10. |
| ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC2) | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 950-223 | Pretreatment steps in the processing of tissue samples during IHC and ISH. Ready to use. |
| ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC1) | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 950-224 | |
| ultraView Silver Wash II | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 780-003 | Ready-to-use solution to rinse slides between IHC and ISH staining steps |
| Microtome | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU | RM 2255 | Automated rotary microtome |
| Multistainer | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU | ST 5020 | Workstation for automated staining and coverslipping |
| Minicore 1 | Alphelys, Plaisir, France, EU | 00-MICO-1 | Semi-automatic arrayer for TMA contruction with TMA Designer 2 embedded software |
| Aperio ScanScope CS2 | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU | K080254 | Image capture device – digital pathology scanner |
| Tissue-Tek III Uni-Cassette | Sakura Finetek Europe B.V | 4135 | Cassette |
| Tissue-Tek Paraform Standard Base Mold | Sakura Finetek Europe B.V | 7055 | Stainless-Steel base metal mold |
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