Immobilisation Caenorhabditis elegans , à analyser le Transport intracellulaire dans les neurones

Résumé

Caenorhabditis elegans (C. elegans) est un bon modèle pour étudier le transport axonal et intracellulaire. Ici, je décris un protocole in vivo d’enregistrement et d’analyse du transport axonal et de chez c. elegans.

Résumé

Transport axonal et transport de (IFT) sont essentiels pour la fonction et morphogenèse axone et les cils. Dynéine et kinésine superfamille des protéines sont des moteurs moléculaires qui régulent antérograde et rétrograde transport, respectivement. Ces moteurs utilisent des réseaux de microtubules comme rails. Caenorhabditis elegans (C. elegans) est un organisme modèle puissant pour étudier le transport axonal et IFT in vivo. Ici, je décris un protocole afin d’observer le transport axonal et IFT vie c. elegans. Marchandises transportées peut être visualisé par marquage des protéines de cargaison à l’aide de protéines fluorescentes comme protéine fluorescente verte (GFP). C. elegans est transparent et protéines GFP-étiquetée de cargaison peuvent être exprimés dans des cellules spécifiques en vertu de promoteurs spécifiques des cellules. Vers vivants peuvent être résolus en microbilles sur gel d’agarose 10 % sans tuer ou anesthésier les vers. Dans ces conditions, mouvement de la cargaison peut être directement observé dans les axones et les cils de la vie c. elegans sans dissection. Cette méthode peut être appliquée à l’observation de n’importe quelle molécule de fret dans toutes les cellules en modifiant les protéines cibles et/ou les ils sont exprimés dans les cellules. Les protéines plus basiques tels que les moteurs moléculaires et protéines d’adaptateur qui sont impliqués dans le transport axonal et IFT sont conservés chez c. elegans. Par rapport aux autres organismes modèles, mutants peuvent être obtenus et maintenus plus facilement chez c. elegans. La combinaison de cette méthode avec divers mutants de c. elegans peut clarifier les mécanismes moléculaires du transport axonal et IFT.

Introduction

L’imagerie de cellules vivantes est un outil essentiel pour l’analyse de transport intracellulaire. En biologie cellulaire neuronale, analyses du transport axonal avec l’imagerie de cellules vivantes sont essentielles pour comprendre la fonction et la morphogenèse neuronale¹. Défauts dans le transport axonal sous-tendent plusieurs de troubles neurodégénératifs². Kinésine superfamille des protéines et dynéine effectuer le transport axonal axonales et marqués, respectivement^1,2.

Cils sont un autre compartiment cellulaire dans lequel le r....

Protocole

1. préparation des échantillons

1. générer un transgénique c. elegans souche d’intérêt à l’aide de méthodes transgéniques ¹⁸. Également obtenir des souches appropriées de la centre de génétique de Caenorhabditis (CCG). Pour visualiser le transport axonal des précurseurs de la vésicule synaptique, utiliser la lignée transgénique wyIs251 [Pmig-13::gfp::rab-3] ⁷. Pour observer l’IFT, obtenir la lignée transgénique mnIs17 [osm-6::gfp] ¹⁹. Ces souches sont utilisés dans le présent protocole.
   Remarque : Soit tableau extrachromosomiq....

Résultats

Transport axonal dans le neurone AD9
En utilisant la ligne de wyIs251 , les antérograde et rétrograde transport axonal de GFP::RAB-3 peut être enregistrée simultanément dans le motoneurone AD9. La vitesse moyenne d’antérograde et rétrograde transport dans l’axone proximale dorsale du neurone AD9 est environ 1.8 et 2,6 μm/s, respectivement²². Le nombre de vésicules mobiles est environ 0,03 et 0,018 par μm d’axone par s. Ainsi, pour une o.......

Discussion

Limitation en ce qui concerne les méthodes existantes
La méthode décrite ici est optimisée afin d’observer les événements rapides tels que le transport axonal et IFT. Ainsi, immobilisation est plus prioritaire que d’incubation plus longue. Alors que nous avons pu observer les événements trafic pendant au moins 20 min sans perturbation significative, cette méthode peut ne pas convenir toujours d’observer les événements lentes nécessitant des observations plus longues, telles que l’allongement de l’axon.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Slideglass (76 x 26 mm)	Matsunami	S1111
Coverglass (22 x 40 mm)	Matsunami	C024401
Agarose	Wako	318-01195
Microbilles de polystylene 0,1 micron	Polysciences	#00876
Bloc chauffant	TAITEC	0063288-000	CTU-mini
Microscope	Olympus	IX-71	microscope grand champ
Scanner à disque rotatif	Yokogawa	CSU-X1	scanner confocal à disque rotatif  ;
Caméra CCD numérique	Hamamatsu Photonics	C10600-10B	Caméra CCD dégitale ORCA-R2
Objectif (x100, NA1.4)	Pipette Pasteur Olympus	UPLSAPO 100XO
(5 pouces)	IWAKI	IK-PAS-5P
Tube en verre (1,5 cm de diamètre x 10,5 cm)	IWAKI	9820TST15-105NP
TV9211 : wyIs251	Laboratoire de Kang Shen	N/A
OTL11 : mnIs17	Ref. 27, 29	N/A	SP2101 a été rétrocroisé avec le type sauvage pour 6 fois
Stéréomicroscope	Carl Zeiss	435064-9000-000	STEMI 508  ;
Unité de transillumination du miroir	Carl Zeiss	435425-9010-000
fil de platine (0,2 mm)	Nilaco Corporation	m78483501
60 mm plat en plastique	Falcon	#351007
Fiji	N/A	N/A
milieu de croissance des nématodes (NGM)  ;   ;			1,7 % (p/v) d’agarose, 50 mM de NaCl, 0,25 % (p/v) de peptone, 1 mM de CaCl2, 5 mg/mL de cholestérol, 25 mM de KH2PO4, 1 mM de MgSO4 ;

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