Expression transitoire de gènes étrangers dans des cellules d’insecte (sf9) pour l’analyse fonctionnelle de la protéine

Résumé

Ce protocole décrit un système d’expression de protéine induite par le choc de chaleur (système de pile à pDHsp/V5-His/sf9), qui peut être utilisé pour exprimant des protéines étrangères ou évaluation de l’activité anti-apoptotique de protéines étrangères potentiels et leur tronqué amine acides dans les cellules d’insectes.

Résumé

Le système d’expression de gène transitoire est une des technologies plus importantes permettant d’effectuer l’analyse fonctionnelle de protéines dans le baculovirus in vitro système de culture cellulaire. Ce système a été développé pour des gènes étrangers expriment sous le contrôle du promoteur baculoviral dans les plasmides d’expression transitoire. En outre, ce système peut être appliqué à un test fonctionnel du baculovirus lui-même ou des protéines étrangères. Le système d’expression génétique transitoire plus largement et commercialement disponible est développé basé sur le promoteur du gène précoce immédiat (IE) de Orgyia pseudotsugata pourcentage nucleopolyhedrovirus (OpMNPV). Cependant, un niveau faible expression de gènes étrangers dans des cellules d’insectes a été observé. Par conséquent, un système d’expression de gène transitoire a été construit pour améliorer l’expression de la protéine. Dans ce système, les plasmides recombinants furent construits pour contenir la séquence cible sous le contrôle du Drosophila chaleur choc 70 (Dhsp70) promoteur. Ce protocole présente l’application de cette chaleur axée sur le choc pDHsp/V5-His (épitope V5 avec 6 histidine) /Spodoptera frugiperda cellule système (cellules sf9) ; ce système est disponible non seulement pour l’expression des gènes mais aussi pour évaluer l’activité anti-apoptotique des protéines de candidat dans des cellules d’insecte. En outre, ce système peut être soit transfecté avec un plasmide recombinant ou transfectées conjointement deux plasmides recombinants potentiellement fonctionnellement antagonistes dans des cellules d’insecte. Le protocole montre l’efficacité de ce système et fournit un cas pratique de cette technique.

Introduction

Deux systèmes d’expression de protéines ont été couramment utilisées pour produire des protéines : systèmes d’expression de protéine procaryote (système d’expression géniqueEscherichia coli ) et des systèmes d’expression protéine eucaryote. Un système d’expression de protéine eucaryote populaire est les baculovirus expression vector system (BEVS)¹. Les baculovirus ont été utilisées comme agents de lutte biologique dans le monde entier d’agricoles et sylvicoles nuisibles. Dans les dernières décennies, les baculovirus ont été élaborés comme des outils biotechnologiques pour les vecteurs d’expression protéique ainsi. Le génome des baculov....

Protocole

1. les préparatifs

1. Culture cellulaire insectes
   1. Préparer 50 mL de milieu de culture cellulaire. Pour ce faire, ajouter 500 µL d’antibiotiques (amphotéricine B = 0,25 µg/mL, la pénicilline = 100 unités/mL, streptomycine = 100 µg/mL) et 5 mL de sérum bovin fœtal inactivés par la chaleur dans le milieu de culture sans sérum cellulaire (sans antibiotiques ou FBS).
      Remarque : Faire chauffer le sérum de veau fœtal à 65 ° C pendant 30 min dans un bain d’eau avant utilisation.
   2. Maintenir Spodoptera frugiperda (Lepidoptera : Noctuidae), des cellules d’insecte sf9. Détacher environ 80 % des cellules du flacon de culture ce....

Résultats

Toute la longueur et autres deux troncatures (domaines BIR et anneau) de Ly-IAP3 de LyxyMNPV étaient surexprimés dans les cellules sf9, basée sur la chaleur axée sur le choc pDHsp/V5-His /Spodoptera frugiperda cellulaire (cellules sf9). Le pDHsp/V5-His contenait un drosophile chaleur choc promoteur de la protéine, qui entraîne l’expression des gènes en aval à une température de 42 ° C condition en utilisant des facteurs de transcriptionnelles cellulaires et la translatio.......

Discussion

Le concept de système de pile à pDHsp/V5-His/sf9 axée sur le choc thermique a été décrite par Clem et al. , 1994,⁸. Comparaison du promoteur du gène baculoviral (IE1) et Drosophila hsp70 a montré que hsp70 avaient une plus grande efficacité en moustique cellules¹⁰. En outre, en raison de l’induction de choc thermique, le moment d’expression de la protéine pourrait être contrôlé précisément après le traitement de choc thermique. Ce système.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Antibiotique-Antimycosique, 100X	Gibco	15240-062	pour la culture de cellules d’insectes
Sérum de veau fœtal certifié	Bioind	04-001-1A
Sf-900 II SFM	Thermo Fisher	10902096	milieu de culture cellulaire sans sérum
Cellules Sf9 ATCC		CRL-1711
Flacon de culture cellulaire de 25cm2	Nunc, Thermo Fisher	156340
Microscopie à lumière inversée	WHITED	WHITED WI-400
RBC HIT Competent Cell	Bioman	RH618-J80	Escherichia coli (DH5&alpha ;)
L.B. Bouillon (Miller)	Gélose Bioman	LBL407
, qualité bactériologique	Bioman	AGR001
Zeocin	Invitrogen	ant-zn-1	sélection antibiotique
PCR Master Mix (2X)	ThermoFisher	K0171
Geneaid Midi Plasmid Kit (sans endotoxines)	Geneaid	PIE25
Actinomycine D	SIGMA	A9415
Corning 50 mL Tubes à centrifuger	SIGMA	CLS430829-500EA	50 mL
Tubes Hémocytomètre	Gizmo Supply Co	B-CNT-SLDE-V2
24-Well Multidish	Nunc, Thermo Fisher	142475	24 puits
Cellfectin II Réactif	Thermo Fisher	10362100	cell transfectin
réactif PBS-Phosphate-Buffered Saline (10X) pH 7.4	Thermo Fisher	AM9624
4× ; Colorant	Bioman	P1001
Immobilon-P (Membranes buvardoises PVDF)	Membranes PVDF	Merck Milipore	IPVH00010
Système cellulaire Mini Trans-Blot	BIO-RED	1703930	Buvard
Ponceau S solution	SIGMA	6226-79-5
Anti-V5	SIGMA	V8137	anti-V5 anti-V5
Chèvre anti-lapin IgG-raifort peroxydase (HRP)	Jackson	111-035-003
Tween 20	Merck	817072
6-Well Multidish	Nunc, Thermo Fisher	145380
0,4 % trypan blue solution	AMRESCO	K940-100ML
P10 pipetman	Gilson	F144802
P1000 pipetman	Gilson
Ruban	Symbio	PPS7	24 puits ( 19 mm× ; 36 M)

F123602