كله "تسلسل الجينوم" المبيضات صناعي "الكشف عن علامات للمقاومة المضادة للفطور المخدرات"
Summary
نفذت هذه الدراسة تسلسل الجينوم الكامل لتحليل الطفرات في الجينات منح المقاومة للعقاقير المضادة للفطور في المبيضات صناعي. كانت متتابعة يعزل صناعي جيم- مقاومة اتشينوكاندينس، الآزولات و 5-فلوسيتوسيني، لتوضيح المنهجية. التشكيلات الجانبية للقابلية يعزل يرتبط بوجود أو عدم وجود أنماط محددة من الطفرة في الجينات.
Abstract
ويمكن اكتساب صناعي المبيضات سرعة الطفرات التي تؤدي إلى مقاومة المخدرات، لا سيما الآزولات واتشينوكاندينس. تحديد الطفرات الوراثية أمر أساسي، كما كشف المقاومة في المختبر يمكن غالباً ما يرتبط بفشل السريرية. قمنا بفحص جدوى استخدام تسلسل الجينوم كله (WGS) لتحليل المجين على نطاق المنظومة لمقاومة العقاقير المضادة للفطور في جيم-صناعي. والهدف كان المساعدون توريكوجنيزي والحواجز في الأفرقة العاملة لتنفيذ وقياس فعاليته. وتلخص هذه الورقة في نقاط التفتيش الرئيسية في مجال مراقبة الجودة والمكونات الأساسية للأفرقة العاملة لمنهجية التحقيق البصمات الجينية المرتبطة بتخفيض التعرض للعوامل المضادة للفطور. وتقدر أيضا دقة تحليل البيانات ودورة حول الوقت للاختبار.
قابلية المظهرية من 12 السريرية، وواحد من سلالة ATCC من صناعي جيم- مصممة عن طريق اختبار قابلية المضادة للفطور. عزل هذه شملت ثلاثة أزواج من المرضى الثلاثة، التي وضعت ارتفاع تركيزات العقاقير المثبطة الدنيا. في اثنين من أزواج، عزل الثاني لكل زوج وضع مقاومة اتشينوكاندينس. عزل ثاني زوج الثالثة وضعت المقاومة إلى 5-فلوسيتوسيني. المتبقية المؤلفة من عرضه ومقاومة الازول يعزل. وتأكدت النوكليوتيدات واحدة مجمع الأشكال المتعددة (بطانات) في الجينات المرتبطة بالمقاومة اتشينوكاندين والازول فلوسيتوسيني 5 في يعزل مقاومة من خلال الأفرقة العاملة لاستخدام تسلسل الجيل القادم. بطانات عدم مرادفة في مقاومة الفطريات وتم تحديد الجينات مثل FKS1، FKS2، CgPDR1، CgCDR1 ، و FCY2 . وعموما، في متوسط 98% القراءات WGS من يعزل صناعي جيم- المعينة للجينوم مرجع مع تغطية حوالي 75-fold عمق القراءة. المدة الزمنية والتكلفة كانت مماثلة سانغر التسلسل.
وفي الختام، WGS صناعي جيم- كان ممكناً في الكشف عن الطفرات الجينية سريرياً هامة تشارك في المقاومة لفئات مختلفة من العقاقير المضادة للفطور دون الحاجة إلى عدة ردود فعل تسلسل بكر/الحمض النووي. وهذا يمثل خطوة إيجابية نحو إنشاء قدرة الأفرقة العاملة في المختبرات السريرية للكشف المتزامن استبدالات تخول المقاومة المضادة للفطور.
Introduction
هو صناعي المبيضات ممرض مصادفة على نحو متزايد بأهمية الأنواع الذي يسلك المقاومة الآزولات وكذلك في الآونة الأخيرة،2،1،اتشينوكاندينس3. على عكس مثنوية المبيضة، فرداني جينوم صناعي جيم- قد تسمح لها بالحصول على الطفرات وتطوير المقاومة للعقاقير المتعددة بسهولة أكبر. وأفادت المقاومة المشارك فئات المخدرات على حد سواء كان أيضا4. ومن ثم، التقييم المبكر لقابلية المضادة للفطور والكشف عن المقاومة للعقاقير في جيم-صناعي أمر حاسم للعلاج الصحيح، وهادفة، وكذلك كما هو الحال في سياق الإشراف مضاد للحد من العوامل المحركة لمقاومة مضادات الميكروبات1 , 5 , 6-إنشاء سير عمل فعالة لسرعة الكشف عن وجود توكيدي الطفرات المرتبطة بالمؤشرات الحيوية المقاومة في مقاومة يعزل سيتم أيضا إلى المساعدة على تحسين وصف المقررات والنتائج السريرية.
وعادة ما يتم تقييم القابلية المضادة للفطور بقياس تركيز الحد الأدنى المثبطة (MIC) الذي يعرف بأنه أدنى تركيز المخدرات التي ينتج عنها انخفاض كبير في نمو الكائنات الدقيقة المقارنة مع نمو خال من المخدرات عنصر التحكم. السريرية ومعهد المعايير المختبرية (كلسي) واللجنة الأوروبية على الميكروبات قابلية الاختبار (يوكاست) قد توحيد قابلية طرق الاختبار من أجل البت في هيئة التصنيع العسكري أكثر دقة واتساقا7، 8. بيد الفائدة من الأدوية المضادة للفطور هيئة التصنيع العسكري لا تزال محدودة لا سيما بالنسبة اتشينوكاندينس، خاصة فيما يتعلق بإجراء مقارنات المختبرات فيها منهجيات مختلفة والشروط المستخدمة9. وهناك أيضا ترابط غير مؤكد من البلدان المتوسطة الدخل مع الاستجابة للعلاج اتشينوكاندين وعدم القدرة على التمييز بين WT (أو عرضه) المعزولة من تلك التي تأوي FKS الطفرات (سلالات مقاومة اتشينوكاندين)10،11. وعلى الرغم من توافر تقارير إتمام المشروعات وحيدة الجين توكيدي وسانجر تسلسل علامات المقاومة المضادة للفطور، تحقيق النتائج غالباً ما يتأخر الواجب لعدم الكشف عن واحد من علامات المقاومة متعددة5،12. ومن ثم، المتزامنة الكشف عن الطفرات المقاومة منح في مواقع مختلفة في الجينوم، مكنت من التحليل القائم على تسلسل الجينوم كله، يوفر مزايا هامة أكثر من النهج الحالي.
الجينوم كله التسلسل (WGS) نفذت بنجاح لتتبع انتقال المرض خلال تفشي فضلا عن نهج لمقاومة المخدرات وتقييم المخاطر على نطاق الجينوم الاختبار في البكتيريا والفيروسات13. التطورات الحديثة في تكنولوجيا تسلسل الحمض النووي جعلت تسلسل الجينوم كله (WGS) من مسببات الأمراض في عملي سريرياً بدوره حولها-وقت مجدية تقنيا واقتصادياً على حد سواء. تسلسل الحمض النووي يوفر مزايا هامة على أساليب أخرى لتحديد العوامل الممرضة وتوصيف المستخدمة في علم الأحياء المجهرية المختبرات14،،من1516. أولاً، أنه يوفر حلاً عالمياً مع ارتفاع الإنتاجية والسرعة والجودة. التسلسل يمكن تطبيقها على أي من الكائنات الحية الدقيقة ويسمح وفورات الحجم في المختبرات المحلية أو الإقليمية. وثانيا، أنها تنتج البيانات في تنسيق ‘المستقبل واقية’ قابلة للمقارنة على المستويين الوطني والدولي. وأخيراً، زادت الفائدة المحتملة للأفرقة العاملة في مجال الطب بالنمو السريع لقواعد البيانات العامة التي تحتوي على مرجع جينومات، التي يمكن ربطها بقواعد بيانات معادلة التي تحتوي على بيانات تعريف إضافية السريرية والوبائية17 ،18.
وقد أثبتت الدراسات الأخيرة لفائدة من الأفرقة العاملة لتحديد علامات المقاومة المضادة للفطور من يعزل السريرية من المبيضات spp. 10 , 19 , 20-وهذا في الغالب بسبب توافر التعاقب benchtop الفائق والمعلوماتية أنشئت خطوط الأنابيب وانخفاض التكلفة لتسلسل21،22. الاستفادة من الأفرقة العاملة للفطريات عبر سانغر التسلسل WGS يسمح تسلسل الجينوم متعددة على تشغيل واحد. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن تحديد الطفرات الرواية في أهداف المخدرات WGS الجينومات المبيضات ، تتبع التطور الجيني، وظهور أنواع التسلسل ذات الصلة سريرياً20،،من2223. الأهم من ذلك، في حالات مقاومة عصيات الجوهرية، WGS يمكن أن تساعد في الكشف المبكر عن الطفرات المقاومة تمنح قبل العلاج التحديد22،24.
هنا، قمنا بدراسة الجدوى للأفرقة العاملة لتمكين الكشف عن الطفرات المرتبطة بالعقاقير المقاومة لفئات مختلفة من العوامل المضادة للفطور. نقدم منهجية لتنفيذ WGS من منظوري مختبر علم الفطريات التشخيصية والمستخدم النهائي. وأدرجنا في هذا التحليل عزل ثلاثة أزواج مثقف من ثلاث حالات سريرية منفصلة في التي في المختبر وضعت المقاومة اتشينوكاندينس و 5-فلوسيتوسيني مع مرور الوقت بعد العلاج المضادة للفطور.
Protocol
Representative Results
Discussion
تحدد هذه الدراسة الجدوى والحدود الزمنية التقريبية والدقيقة الموجهة بالأفرقة العاملة للكشف عن مقاومة العقاقير في جيم-صناعي. وكان الزمنية (تأت) اللازمة لإعداد مكتبة وتسلسل أربعة أيام، والإبلاغ عن نتائج تحليل 1-2 يوما. ويقارن هذا مع على الأقل مبلغ مماثل تأت لفحوصات الحساسية من لوحات الث?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل المركز للأمراض المعدية وعلم الأحياء المجهرية، والصحة العامة. المؤلفين لم تتلق أي تمويل آخر لهذه الدراسة. يشكر المؤلفون Drs أليسيا ارنوت، باخمان ناثان ورانجيتا مينون لمشورة الخبراء والمساعدة مع التجربة تسلسل الجينوم كله.
Materials
| DensiCHECK Plus | BioMérieux Inc | K083536 | Densitometer used for McFarland readings |
| Sensititre YeastOne | TREK Diagnostic Systems, Thermo Scientific | YO10 | Commercial susceptibility assay plate with standard antifungal drugs. |
| Fisherbrand Disposable Inoculating Loops and Needles | Fisher Scientific, Thermo Fisher Scientific | 22-363-605 | Disposable plastic loops can be used directly from package. No flaming required. |
| Eppendorf Safe-Lock microcentrifuge tubes | Sigma Aldrich, Merck | T2795 | Volume 2.0 mL, natural |
| ZYMOLYASE 20T from Arthrobacter luteus | MP Biomedicals, LLC | 8320921 | Used for cell wall lysis of fungal isolate before DNA extraction |
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120 | Does 100 DNA extractions |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | P7589 | Picogreen reagent referred to as fluorescent dye in the protocol. Includes Lambda DNA standard and picogreen reagent for assay. |
| Nextera XT DNA Sample Preparation Kit | Illumina | FC-131-1096 | Includes Box 1 and Box 2 reagents for 96 samples |
| Nextera XT Index Kit v2 | Illumina | FC-131-2001, FC-131-2002, FC-131-2003, FC-131-2004 |
Index set A Index set B Index set C Index set D |
| NextSeq 500/550 High Output Kit v2 | Illumina | FC-404-2004 | 300 cycles, More than 250 samples per kit |
| NextSeq 500 Mid Output v2 Kit | Illumina | FC-404-2003 | 300 cycles, More than 130 samples per kit |
| PhiX Control Kit | Illumina | FC-110-3001 | To arrange indices from Index kit in order |
| TruSeq Index Plate Fixture Kit | FC-130-1005 | 2 Fixtures | |
| KAPA Library Quantification Kit for Next-Generation Sequencing |
KAPA Biosystems | KK4824 | Includes premade standards, primers and MasterMix |
| Janus NGS Express Liquid handling system | PerkinElmer | YJS4NGS | Used for DNA dilutions during sequencing |
| 0.8 mL Storage Plate | Thermo Scientific | AB0765B | MIDI Plate for DNA Library cleanup and normalisation |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 | Magnetic beads in solution for library purification |
| Magnetic Stand-96 | Thermo Fisher Scientific | AM10027 | Used for magnetic bead based DNA purification |
| OrbiShaker MP | Benchmark Scientific | BT1502 | 96-well plate shaker with 4 platforms |
| Hard Shell PCR Plate | BioRad | HSP9601 | Thin Wall, 96 Well |
| LightCycler 480 Instrument II | Roche | 5015278001 | Accomodates 96 well plate |
| Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical | BioRad | MSB1001 | Clear 96-well plate sealers |
| CLC Genomics Workbench | Qiagen | CLCBio | Software for data analysis, Version 8 |
| NextSeq500 instrument | Illumina | Illumina | Benchtop Sequencer used for next generation sequencing |
References
- Beyda, N. D., et al. FKS mutant Candida glabrata: risk factors and outcomes in patients with candidemia. Clin Infect Dis. 59 (6), 819-825 (2014).
- Chapeland-Leclerc, F., et al. Acquisition of flucytosine, azole, and caspofungin resistance in Candida glabrata. bloodstream isolates serially obtained from a hematopoietic stem cell transplant recipient. Antimicrob Agents Chemother. 54 (3), 1360-1362 (2010).
- Glockner, A., Cornely, O. A. Candida glabrata-unique features and challenges in the clinical management of invasive infections. Mycoses. 58 (8), 445-450 (2015).
- Pfaller, M. A., et al. Frequency of decreased susceptibility and resistance to echinocandins among fluconazole-resistant bloodstream isolates of Candida glabrata. J Clin Microbiol. 50 (4), 1199-1203 (2012).
- Lewis, J. S., Wiederhold, N. P., Wickes, B. L., Patterson, T. F., Jorgensen, J. H. Rapid emergence of echinocandin resistance in Candida glabrata resulting in clinical and microbiologic failure. Antimicrob Agents Chemother. 57 (9), 4559-4561 (2013).
- Klevay, M. J., et al. Therapy and outcome of Candida glabrata versus Candida albicans bloodstream infection. Diagn Microbiol Infect Dis. 60 (3), 273-277 (2008).
- Arendrup, M. C., Cuenca-Estrella, M., Lass-Florl, C., Hope, W., Eucast, A. EUCAST technical note on the EUCAST definitive document EDef 7.2: method for the determination of broth dilution minimum inhibitory concentrations of antifungal agents for yeasts EDef 7.2 (EUCAST-AFST). Clin Microbiol Infect. 18 (7), 246-247 (2012).
- . Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Yeasts. Clinical and Laboratory Standards Institute. , (2012).
- Arendrup, M. C., Pfaller, M. A. Danish Fungaemia Study, G. Caspofungin Etest susceptibility testing of Candida species: risk of misclassification of susceptible isolates of C. glabrata and C. krusei when adopting the revised CLSI caspofungin breakpoints. Antimicrob Agents Chemother. 56 (7), 3965-3968 (2012).
- Singh-Babak, S. D., et al. Global analysis of the evolution and mechanism of echinocandin resistance in Candida glabrata. PLoS Pathog. 8 (5), 1002718 (2012).
- Shields, R. K., Nguyen, M. H., Clancy, C. J. Clinical perspectives on echinocandin resistance among Candida species. Curr Opin Infect Dis. 28 (6), 514-522 (2015).
- Dudiuk, C., et al. Set of classical PCRs for detection of mutations in Candida glabrata FKS. genes linked with echinocandin resistance. J Clin Microbiol. 52 (7), 2609-2614 (2014).
- Koboldt, D. C., Steinberg, K. M., Larson, D. E., Wilson, R. K., Mardis, E. R. The next-generation sequencing revolution and its impact on genomics. Cell. 155 (1), 27-38 (2013).
- Barzon, L., et al. Next-generation sequencing technologies in diagnostic virology. J Clin Virol. 58 (2), 346-350 (2013).
- Didelot, X., Bowden, R., Wilson, D. J., Peto, T. E. A., Crook, D. W. Transforming clinical microbiology with bacterial genome sequencing. Nat Rev Gen. 13 (9), 601-612 (2012).
- Koser, C. U., et al. Routine use of microbial whole genome sequencing in diagnostic and public health microbiology. PLoS Pathog. 8 (8), 1002824 (2012).
- Lipkin, W. I. The changing face of pathogen discovery and surveillance. Nat Rev Microbiol. 11 (2), 133-141 (2013).
- Sintchenko, V., Holmes, E. C. The role of pathogen genomics in assessing disease transmission. BMJ. 350, 1314 (2015).
- Garnaud, C., et al. Next-generation sequencing offers new insights into the resistance of Candida spp. to echinocandins and azoles. J Antimicrob Chemother. 70 (9), 2556-2565 (2015).
- Sanmiguel, P. Next-generation sequencing and potential applications in fungal genomics. Methods Mol Biol. 722, 51-60 (2011).
- Mardis, E. R. Next-generation sequencing platforms. Annu Rev Anal Chem. 6, 287-303 (2013).
- Zoll, J., Snelders, E., Verweij, P. E., Melchers, W. J. Next-Generation Sequencing in the mycology lab. Curr Fungal Infect Rep. 10, 37-42 (2016).
- Chrystoja, C. C., Diamandis, E. P. Whole genome sequencing as a diagnostic test: challenges and opportunities. Clin Chem. 60 (5), 724-733 (2014).
- Biswas, C., et al. Identification of genetic markers of resistance to echinocandins, azoles and 5-fluorocytosine in Candida glabrata by next-generation sequencing: a feasibility study. Clin Microbiol Infect. , (2017).
- Glasel, J. A. Validity of nucleic acid purities monitored by 260nm/280nm absorbance ratios. BioTechniques. 18 (1), 62-63 (1995).
- Cannon, R. D., et al. Efflux-mediated antifungal drug resistance. Clin Microbiol Rev. 22 (2), 291-321 (2009).
- Ferrari, S., et al. Gain of function mutations in CgPDR1. of Candida glabrata not only mediate antifungal resistance but also enhance virulence. PLoS Pathog. 5 (1), 1000268 (2009).
- Rodrigues, C. F., Silva, S., Henriques, M. Candida glabrata: a review of its features and resistance. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 33 (5), 673-688 (2014).
- Garcia-Effron, G., Lee, S., Park, S., Cleary, J. D., Perlin, D. S. Effect of Candida glabrata FKS1 and FKS2 mutations on echinocandin sensitivity and kinetics of 1,3-beta-D-glucan synthase: implication for the existing susceptibility breakpoint. Antimicrob Agents Chemother. 53 (9), 3690-3699 (2009).
- Arendrup, M. C., Perlin, D. S. Echinocandin resistance: an emerging clinical problem. Curr Opin Infect Dis. 27 (6), 484-492 (2014).
- Costa, C., et al. New Mechanisms of Flucytosine Resistance in C. glabrata Unveiled by a Chemogenomics Analysis in S. cerevisiae. PLoS One. 10 (8), 0135110 (2015).
- de Groot, P. W., Bader, O., de Boer, A. D., Weig, M., Chauhan, N. Adhesins in human fungal pathogens: glue with plenty of stick. Eukaryot Cell. 12 (4), 470-481 (2013).
- de Groot, P. W., et al. The cell wall of the human pathogen Candida glabrata: differential incorporation of novel adhesin-like wall proteins. Eukaryot Cell. 7 (11), 1951-1964 (2008).
- Vale-Silva, L. A., et al. Upregulation of the adhesin gene EPA1 mediated by PDR1 in Candida glabrata leads to enhanced host colonization. mSphere. 1 (2), (2016).
