הגנום כולו רצף של קנדידה glabrata עבור זיהוי של סמנים של פטריות תרופתיים
Summary
מחקר זה מיושם רצף הגנום כולו עבור ניתוח של מוטציות בגנים היוועצות תרופתיים פטרת, קנדידה glabrata. Glabrata ג מבודד עמידים echinocandins, azoles ו- 5-flucytosine, היו רציף כדי להמחיש את המתודולוגיה. הרגישות פרופילים של מבודד בקורלציה עם נוכחות או היעדרות של המוטציה דפוסי בגנים.
Abstract
קנדידה glabrata יכול לרכוש במהירות מוטציות שגורמות עמידות לתרופות, במיוחד אל azoles ואל echinocandins. זיהוי של מוטציות גנטיות חיוני, כמו ההתנגדות זוהה במבחנה ניתן לעיתים קרובות בקורלציה עם כשלון קליני. בדקנו את הכדאיות של שימוש רצף הגנום כולו (WGS) לניתוח ברמת הגנום של עמידות לתרופות נגד פטריות ב- glabrata ג. המטרה הייתה torecognize נחותות ומחסומים ביישום WGS ומדידת יעילותו. מאמר זה מתאר את בקרת איכות מפתח מחסומים ואת מרכיבים חיוניים של מתודולוגיה WGS לחקור גנטיים המשויכים הרגישות מופחתת סוכני פטריות. זה גם מעריך את הדיוק של ניתוח נתונים, סיבוב סביב הזמן של בדיקות.
הרגישות פנוטיפי של 12 קליני, בקרת האוויר אחד, מזן glabrata ג נקבע באמצעות בדיקות רגישות נגד פטריות. שלושת אלה כלולים לבודד זוגות, של שלושה מטופלים, שהתפתח עלייה בריכוזים מעכבות המינימלי סמים. ב שני זוגות, השני בודד של כל זוג פיתח עמידות echinocandins. בידוד השני בזוג השלישי פיתח עמידות 5-flucytosine. הנותרים מורכבת רגישים ועמיד azole מבודד. פולימורפיזמים נוקלאוטיד יחיד (SNPs) גנים הקשורים echinocandin, azole והתנגדות 5-flucytosine היו אישר מבודד עמיד דרך WGS באמצעות רצף הדור הבא. SNPs Non-נרדף בהתנגדות פטריות זוהו גנים כגון FKS1, FKS2, CgPDR1, CgCDR1 , FCY2 . בסך הכל, ממוצע של 98% הקריאות WGS של glabrata ג מבודד למפות את הגנום הפניה עם כיסוי על 75-fold עומק קריאה. משך העבודה והעלות היו דומות סנגר רצף.
לסיכום, WGS של glabrata ג היה ריאלי בגילוי משמעות קלינית מוטציות מעורב ההתנגדות סמים פטריות שונות שיעורים ללא צורך מרובים PCR/DNA רצף תגובות. זה מייצג צעד חיובי לקראת הקמת WGS יכולת במעבדה קלינית לגילוי סימולטני של החלפות ומעניקה עמידות נגד פטריות.
Introduction
קנדידה glabrata הוא הפתוגן יותר ויותר המערכת נתקלה עם חשיבות כמו זן תערוכות ההתנגדות של azoles וכן לאחרונה,2,1,echinocandins3. בניגוד דיפלואידי אלביקנס ג, הגנום הפלואידי של glabrata ג עשוי לאפשר לו לרכוש מוטציות ולפתח עמידות לתרופות מרובות בקלות רבה יותר. ההתנגדות שותף עד שתי הכיתות סמים היה גם דיווח על4. לפיכך, הערכה מוקדמת של פטריות רגישות וזיהוי של עמידות לתרופות ב glabrata ג הוא קריטי עבור גם טיפול נכון, יישוב כמו ההקשר של סדרנות פטריות להגביל את מנהלי ההתקנים של עמידות מיקרוביאלית1 , 5 , 6. הקמת זרימת עבודה יעילה במהירות לזהות הנוכחות של מוטציות מאשרות מקושר סמנים ההתנגדות מבודד עמיד יהיה גם עזרה לשיפור יגרור החלטות התוצאות הקליניות.
הרגישות פטריות מוערך בדרך כלל על ידי מדידת הריכוז המעכב המינימלי (MIC) אשר מוגדר את ריכוז התרופה הנמוך, שמביאה לירידה משמעותית בצמיחה של מיקרואורגניזם לעומת זה של גידול ללא סמים שליטה. קלינית, מכון תקנים מעבדה (CLSI) ואת הוועדה האירופית-מיקרוביאלית הרגישות בדיקות (EUCAST) יש סטנדרטית הרגישות בדיקות בשיטות כדי להפוך מיקרופון נחישות יותר מדויקים ועקביים7, 8. עם זאת, השירות של מיקרופון פטריות נותר מוגבל במיוחד עבור echinocandins, בפרט לגבי השוואות inter-laboratory היכן מתודולוגיות שונות ותנאים נמצאים בשימוש9. יש גם קורלציה לא בטוח של מיקרופונים עם תגובה לטיפול echinocandin, יכולת להבחין WT (או רגישים) מבודד מאלה מחסה FKS מוטציות (זנים עמידים echinocandin)10,11. למרות הזמינות של מותני יחיד-גן מאשרות ו סנגר רצף של סמני עמידות נגד פטריות, מימוש התוצאות לעיתים קרובות מתעכבת בשל חוסר זיהוי בו זמנית של מספר ההתנגדות סמני5,12. לפיכך, זיהוי בו-זמניות של היוועצות ההתנגדות מוטציות במיקומים שונים בגנום, מופעל על-ידי ניתוח המבוסס על רצף הגנום כולו, מציעה יתרונות רבים על פני לגישות.
הגנום כולו רצף (WGS) יושמה בהצלחה כדי לעקוב אחר העברת המחלה בעת התפרצויות, כמו גם גישה עבור הסיכון הגנום כולו הערכת סמים והתנגדות בדיקות חיידקים ווירוסים13. ההתקדמות בטכנולוגיית רצפי חומצות גרעין הפכו את רצף הגנום כולו (WGS) של פתוגנים קלינית שבידיך התור-מסביב-זמן ריאלי הן מבחינה טכנית והן מבחינה כלכלית. רצפי DNA מציע יתרונות חשובים על פני שיטות אחרות של פתוגן זיהוי ואפיון המועסקים ב מיקרוביולוגיה מעבדות14,15,16. ראשית, הוא מספק פתרון אוניברסלי עם תפוקה גבוהה, מהירות ואיכות. רצף ניתן להחיל על כל מיקרואורגניזמים ומאפשר לגודל במעבדות מקומיים או אזוריים. שנית, הוא מייצר נתונים בתבנית ‘העתיד-הוכחה’ לבצע השוואה ברמות לאומיים ובינלאומיים. בסופו של דבר, השירות פוטנציאל של WGS ברפואה כבר בתוספת מאת צמיחתם המהירה של בסיסי נתונים ציבורי המכיל הפניה הגנום, אשר יכולה להיות קשורה מסדי נתונים שווה ערך להכיל מטה-נתונים קליניים ואפידמיולוגיים נוספים17 ,18.
מחקרים שנעשו לאחרונה הראו את התועלת של WGS לזיהוי סמנים עמידות נגד פטריות מ מבודד קליני של קנדידה spp. 10 , 19 , 20. זאת בעיקר בשל הזמינות של תפוקה גבוהה benchtop סקוונסרים, ביואינפורמטיקה הוקמה צינורות, הפחתת העלות של רצף21,22. היתרון של WGS פטרייתי על סנגר רצף הוא WGS מאפשר רצף של הגנום מרובים בריצה יחיד. בנוסף, WGS של קנדידה הגנום יכול לזהות מוטציות הרומן סמים מטרות, לעקוב אחר ההתפתחות הגנטית, הופעתה של רצף הרלוונטית קלינית-סוגים20,22,23. והכי חשוב, במקרים של התנגדות multidrug מהותי, WGS יכול לסייע בזיהוי מוקדם של מוטציות היוועצות התנגדות לפני טיפול הבחירה22,24.
. בדקנו את הכדאיות של התומכים ב- WGS הקרנה של מוטציות הקשורות תרופתיים לסוגים שונים של סוכני פטריות. אנו מציגים מתודולוגיה ליישום WGS של משתמש הקצה ופרספקטיבות מעבדה מיקולוגיה אבחון. אנו כלולים בניתוח זה לבודד שלושה זוגות תרבותי של שלושה מקרים קליניים נפרדות אשר במבחנה ההתנגדות echinocandins ו- 5-flucytosine שפותחו לאורך זמן בעקבות טיפול נגד פטריות.
Protocol
Representative Results
Discussion
מחקר זה נקבע היתכנות, צירי זמן משוער ודיוק של זיהוי מונחה WGS של עמידות לתרופות ב glabrata ג. זמן טיפול (TAT) כדי להפוך את הספריה הכנת רצף היה ארבעה ימים ודיווח תוצאות שנותחה שתיים ימים. זה משווה עם כמות דומה של פחות TAT על מבחני רגישות בין צלחות לתרבות סנגר רצף עם מספר גבוה משמעותית של דגימות. בס?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי המרכז למחלות זיהומיות, מיקרוביולוגיה, בריאות הציבור. המחברים לא קיבלו כל אחרים מימון למחקר זה. המחברים מודים Drs אלישיה Arnott, נתן בכמן, Ranjeeta מנון על שלהם מומחים יעוץ וסיוע עם הניסוי רצף הגנום כולו.
Materials
| DensiCHECK Plus | BioMérieux Inc | K083536 | Densitometer used for McFarland readings |
| Sensititre YeastOne | TREK Diagnostic Systems, Thermo Scientific | YO10 | Commercial susceptibility assay plate with standard antifungal drugs. |
| Fisherbrand Disposable Inoculating Loops and Needles | Fisher Scientific, Thermo Fisher Scientific | 22-363-605 | Disposable plastic loops can be used directly from package. No flaming required. |
| Eppendorf Safe-Lock microcentrifuge tubes | Sigma Aldrich, Merck | T2795 | Volume 2.0 mL, natural |
| ZYMOLYASE 20T from Arthrobacter luteus | MP Biomedicals, LLC | 8320921 | Used for cell wall lysis of fungal isolate before DNA extraction |
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120 | Does 100 DNA extractions |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | P7589 | Picogreen reagent referred to as fluorescent dye in the protocol. Includes Lambda DNA standard and picogreen reagent for assay. |
| Nextera XT DNA Sample Preparation Kit | Illumina | FC-131-1096 | Includes Box 1 and Box 2 reagents for 96 samples |
| Nextera XT Index Kit v2 | Illumina | FC-131-2001, FC-131-2002, FC-131-2003, FC-131-2004 |
Index set A Index set B Index set C Index set D |
| NextSeq 500/550 High Output Kit v2 | Illumina | FC-404-2004 | 300 cycles, More than 250 samples per kit |
| NextSeq 500 Mid Output v2 Kit | Illumina | FC-404-2003 | 300 cycles, More than 130 samples per kit |
| PhiX Control Kit | Illumina | FC-110-3001 | To arrange indices from Index kit in order |
| TruSeq Index Plate Fixture Kit | FC-130-1005 | 2 Fixtures | |
| KAPA Library Quantification Kit for Next-Generation Sequencing |
KAPA Biosystems | KK4824 | Includes premade standards, primers and MasterMix |
| Janus NGS Express Liquid handling system | PerkinElmer | YJS4NGS | Used for DNA dilutions during sequencing |
| 0.8 mL Storage Plate | Thermo Scientific | AB0765B | MIDI Plate for DNA Library cleanup and normalisation |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 | Magnetic beads in solution for library purification |
| Magnetic Stand-96 | Thermo Fisher Scientific | AM10027 | Used for magnetic bead based DNA purification |
| OrbiShaker MP | Benchmark Scientific | BT1502 | 96-well plate shaker with 4 platforms |
| Hard Shell PCR Plate | BioRad | HSP9601 | Thin Wall, 96 Well |
| LightCycler 480 Instrument II | Roche | 5015278001 | Accomodates 96 well plate |
| Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical | BioRad | MSB1001 | Clear 96-well plate sealers |
| CLC Genomics Workbench | Qiagen | CLCBio | Software for data analysis, Version 8 |
| NextSeq500 instrument | Illumina | Illumina | Benchtop Sequencer used for next generation sequencing |
References
- Beyda, N. D., et al. FKS mutant Candida glabrata: risk factors and outcomes in patients with candidemia. Clin Infect Dis. 59 (6), 819-825 (2014).
- Chapeland-Leclerc, F., et al. Acquisition of flucytosine, azole, and caspofungin resistance in Candida glabrata. bloodstream isolates serially obtained from a hematopoietic stem cell transplant recipient. Antimicrob Agents Chemother. 54 (3), 1360-1362 (2010).
- Glockner, A., Cornely, O. A. Candida glabrata-unique features and challenges in the clinical management of invasive infections. Mycoses. 58 (8), 445-450 (2015).
- Pfaller, M. A., et al. Frequency of decreased susceptibility and resistance to echinocandins among fluconazole-resistant bloodstream isolates of Candida glabrata. J Clin Microbiol. 50 (4), 1199-1203 (2012).
- Lewis, J. S., Wiederhold, N. P., Wickes, B. L., Patterson, T. F., Jorgensen, J. H. Rapid emergence of echinocandin resistance in Candida glabrata resulting in clinical and microbiologic failure. Antimicrob Agents Chemother. 57 (9), 4559-4561 (2013).
- Klevay, M. J., et al. Therapy and outcome of Candida glabrata versus Candida albicans bloodstream infection. Diagn Microbiol Infect Dis. 60 (3), 273-277 (2008).
- Arendrup, M. C., Cuenca-Estrella, M., Lass-Florl, C., Hope, W., Eucast, A. EUCAST technical note on the EUCAST definitive document EDef 7.2: method for the determination of broth dilution minimum inhibitory concentrations of antifungal agents for yeasts EDef 7.2 (EUCAST-AFST). Clin Microbiol Infect. 18 (7), 246-247 (2012).
- . Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Yeasts. Clinical and Laboratory Standards Institute. , (2012).
- Arendrup, M. C., Pfaller, M. A. Danish Fungaemia Study, G. Caspofungin Etest susceptibility testing of Candida species: risk of misclassification of susceptible isolates of C. glabrata and C. krusei when adopting the revised CLSI caspofungin breakpoints. Antimicrob Agents Chemother. 56 (7), 3965-3968 (2012).
- Singh-Babak, S. D., et al. Global analysis of the evolution and mechanism of echinocandin resistance in Candida glabrata. PLoS Pathog. 8 (5), 1002718 (2012).
- Shields, R. K., Nguyen, M. H., Clancy, C. J. Clinical perspectives on echinocandin resistance among Candida species. Curr Opin Infect Dis. 28 (6), 514-522 (2015).
- Dudiuk, C., et al. Set of classical PCRs for detection of mutations in Candida glabrata FKS. genes linked with echinocandin resistance. J Clin Microbiol. 52 (7), 2609-2614 (2014).
- Koboldt, D. C., Steinberg, K. M., Larson, D. E., Wilson, R. K., Mardis, E. R. The next-generation sequencing revolution and its impact on genomics. Cell. 155 (1), 27-38 (2013).
- Barzon, L., et al. Next-generation sequencing technologies in diagnostic virology. J Clin Virol. 58 (2), 346-350 (2013).
- Didelot, X., Bowden, R., Wilson, D. J., Peto, T. E. A., Crook, D. W. Transforming clinical microbiology with bacterial genome sequencing. Nat Rev Gen. 13 (9), 601-612 (2012).
- Koser, C. U., et al. Routine use of microbial whole genome sequencing in diagnostic and public health microbiology. PLoS Pathog. 8 (8), 1002824 (2012).
- Lipkin, W. I. The changing face of pathogen discovery and surveillance. Nat Rev Microbiol. 11 (2), 133-141 (2013).
- Sintchenko, V., Holmes, E. C. The role of pathogen genomics in assessing disease transmission. BMJ. 350, 1314 (2015).
- Garnaud, C., et al. Next-generation sequencing offers new insights into the resistance of Candida spp. to echinocandins and azoles. J Antimicrob Chemother. 70 (9), 2556-2565 (2015).
- Sanmiguel, P. Next-generation sequencing and potential applications in fungal genomics. Methods Mol Biol. 722, 51-60 (2011).
- Mardis, E. R. Next-generation sequencing platforms. Annu Rev Anal Chem. 6, 287-303 (2013).
- Zoll, J., Snelders, E., Verweij, P. E., Melchers, W. J. Next-Generation Sequencing in the mycology lab. Curr Fungal Infect Rep. 10, 37-42 (2016).
- Chrystoja, C. C., Diamandis, E. P. Whole genome sequencing as a diagnostic test: challenges and opportunities. Clin Chem. 60 (5), 724-733 (2014).
- Biswas, C., et al. Identification of genetic markers of resistance to echinocandins, azoles and 5-fluorocytosine in Candida glabrata by next-generation sequencing: a feasibility study. Clin Microbiol Infect. , (2017).
- Glasel, J. A. Validity of nucleic acid purities monitored by 260nm/280nm absorbance ratios. BioTechniques. 18 (1), 62-63 (1995).
- Cannon, R. D., et al. Efflux-mediated antifungal drug resistance. Clin Microbiol Rev. 22 (2), 291-321 (2009).
- Ferrari, S., et al. Gain of function mutations in CgPDR1. of Candida glabrata not only mediate antifungal resistance but also enhance virulence. PLoS Pathog. 5 (1), 1000268 (2009).
- Rodrigues, C. F., Silva, S., Henriques, M. Candida glabrata: a review of its features and resistance. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 33 (5), 673-688 (2014).
- Garcia-Effron, G., Lee, S., Park, S., Cleary, J. D., Perlin, D. S. Effect of Candida glabrata FKS1 and FKS2 mutations on echinocandin sensitivity and kinetics of 1,3-beta-D-glucan synthase: implication for the existing susceptibility breakpoint. Antimicrob Agents Chemother. 53 (9), 3690-3699 (2009).
- Arendrup, M. C., Perlin, D. S. Echinocandin resistance: an emerging clinical problem. Curr Opin Infect Dis. 27 (6), 484-492 (2014).
- Costa, C., et al. New Mechanisms of Flucytosine Resistance in C. glabrata Unveiled by a Chemogenomics Analysis in S. cerevisiae. PLoS One. 10 (8), 0135110 (2015).
- de Groot, P. W., Bader, O., de Boer, A. D., Weig, M., Chauhan, N. Adhesins in human fungal pathogens: glue with plenty of stick. Eukaryot Cell. 12 (4), 470-481 (2013).
- de Groot, P. W., et al. The cell wall of the human pathogen Candida glabrata: differential incorporation of novel adhesin-like wall proteins. Eukaryot Cell. 7 (11), 1951-1964 (2008).
- Vale-Silva, L. A., et al. Upregulation of the adhesin gene EPA1 mediated by PDR1 in Candida glabrata leads to enhanced host colonization. mSphere. 1 (2), (2016).
