DFS70 autoantistoffer etterligner felles sykdomsassosierte antinuclear antistoff mønstre gjør nøyaktig tolkning utfordrende ved konvensjonelle HEp-2 underlag. Protokollen beskriver fordelene med romanen utviklet HEp-2 substrat over konvensjonelle HEp-2 i ANA screening og skille DFS70 mønstre med høy visshet i både monospecific og mixed ANA positive tilfeller.
Systemisk autoimmun bindevev lidelser er preget av sirkulerende antinuclear antistoffer (ANA). Selv om det finnes flere teknologier for ANA screening, fortsatt indirekte immunofluorescence (IIF) bruker Human epithelial celler-2 (HEp-2) substrat primære og anbefalte metoden på grunn av sin overlegne følsomhet. HEp-2 underlag kan oppdage en rekke mønstre som følge av autoantibody binding til ulike protein og nukleinsyre autoantigens distribueres gjennom kjernen og cytoplasm i cellene. Yrende monospecific og blandede mønstre som følge av positive reaksjoner på HEp-2 substrat også komplisere tolkningen og nøyaktigheten av rapportering. Et konkret eksempel som nylig har mottatt stor oppmerksomhet er tett fine flekkete 70 (DFS70) mønsteret som følge av autoantistoffer som spesifikt bindes til et protein som kalles linsen epitel avledet vekstfaktor (LEDGF). Mangelen på klare tilknytning til en bestemt systemisk autoimmun sykdom og høy utbredelse sunn bestander har gjort nøyaktig tolkning av DFS70 mønster viktig. Nøyaktig æren av DFS70 mønster fra sykdomsassosierte mønstre ved hjelp av konvensjonelle HEp-2 underlaget er utfordrende. Dessuten hyppig samtidig forekomst av DFS70 mønster sammen med sykdomsassosierte mønstre som homogen, flekkete og blandet homogen flekkete mønstre komplisere IIF tolkningen. Målet med denne utredningen er å demonstrere nytten av en roman konstruert HEp-2 IIF substrat som beholder alle fordelene med konvensjonelle HEp-2 substrat samtidig gi muligheten til å skille DFS70 mønster med høy visshet i både monospecific og blandet ANA positive eksempler. Nye underlaget er ytterligere kunne avsløre sykdomsassosierte ANA mønstre tidligere skjult av DFS70 mønster.
ANAs er et kjennetegn på autoimmune mediert systemisk bindevev sykdommer1. Flere metoder er ansatt screening og bekreftelse av ANAs. IIF teknikken bruker HEp-2 underlaget er de mest brukte og ofte anbefalt metode for screening ANAs1,2. Til tross for fremskritt i solid fase diagnostiske analysen metoder som enzym koblede immunosorbent analysen (ELISA), enzymimmunanalysen (EIA), chemiluminescence immunanalyse (CLIA) og perle-baserte multiplex analyser er IIF av HEp-2 den mest utbredte Screeningen metoden pga diagnostiske nytten og kostnadene effektivitet1,2,3. Ovennevnte analysen teknologiene stole på et begrenset antall renset innfødt eller rekombinant autoantigens mens HEp-2 celle monolayer forberedelser på glass lysbilde brønner presentere et bredt utvalg av autoantigens i sin naturlige form, fordelt over den kjernen og cytoplasma, som reagerer med autoantistoffer fra pasienten sera eller positiv kontroller, noe som resulterer i en rekke mønstre som er knyttet til ulike autoimmune tilstander. Disse mønstrene er klassifisert i kjernefysiske cytoplasmatiske og mitotisk mønstre basert på plasseringen av antigen i cellene. Hvert mønster og tilhørende antigen/antigener og sykdomstilstander er også preget4. I metoden IIF er pasienten og kontroll-sera ruges på glass lysbilde brønner som presenterer en monolayer kultur HEp-2 celler passende fast å bevare en rekke autoantigens i deres naturlige konfigurasjon. Autoantistoffer i pasienten sera eller positiv kontroller kan bindes til autoantigens presentert av HEp-2 celler på underlaget (objektglass godt) under inkubasjon. Innlegg ved ubundet antistoffer er vasket og bundet antistoffer IgG klassen registreres med fluorescein/fluorescein isothiocyanate (FITC) konjugert anti-human IgG reagens. Ubundet rapportert-konjugert vasket bort og glass coverslips er montert på lysbildene ved hjelp av en montering medium som bevarer reaksjonene og forenkler observasjon under fluorescerende mikroskop. Reaksjoner er observert under fluorescens mikroskop utstyrt med passende eksitasjon-utslipp filter kombinasjon som er konfigurert som reporter brukes (FITC reporter, diagnostiske mikroskop vanligvis bruker filtre med eksitasjon rekke 467 -498 nm og en utslipp rekke 513-556 nm). Tilstedeværelsen av ANA er demonstrert ved en lyse grønne fluorescens spesifikke strukturer i cellene. I motsetning til automatiserte analysen plattformer bruker IIF metodikk møysommelige prosessen med føljetong fortynne sera og visuelle positiv fastsettelse av flekker mønstre som krever betydelig kompetanse5,6. Til tross for disse begrensningene IIF av HEp-2 er de mest brukte og anbefalt metode for screening av ANAs på grunn av standardiseringen innsatsen mot mønster tolkning og nomenklatur av internasjonal konsensus på ANA mønstre (ICAP) komiteen, økt tilgjengelighet av automatiseringsløsninger for IIF lysbildet behandling og resultatet tolkning3.
Blant mange mønstre oppdaget av metoden HEp-2 IIF autoantistoffer målretting psip1 gene produktet (også referert til som LEDGF/p75/DFS70), har fått betydelig interesse de siste årene for flere grunner4,5 ,,6,,7,,8,,9,,10. DFS70 autoantistoffer finnes i høy titers i sunn kontroller, og studier har så langt ikke å demonstrere en distinkt klinisk forening for tilstedeværelse av DFS70 autoantistoffer7,8,9 ,10,11,12,13. Antallet rapporterte positive resultater for DFS70 autoantistoffer i ulike sykdom stater og sunn kohorter store variasjoner mellom studier6,8,9,10,14 ,15,16,17,18,19,20,21,22,23 ,,24,,25,,26,,27,,28. Monospecific DFS70 mønsteret er godt differensiert fra en homogen eller flekkete mønster men tolkning av blandet homogen flekkete mønstre og anti-DFS70 antistoffer co oppstår med andre ANAs er utfordrende selv for ekspert lesere. Den nåværende generasjonen av IIF screening metoder og DFS70 bestemte solid fase analyser er ikke i stand til å skille en monospecific DFS70 reaksjonen fra blandede mønstre (figur 1A, gul skyggelagt av algoritmen). Feiltolkning av DFS70 mønster som homogen, flekkete, blandet mønster, eller omvendt, kan ha alvorlige konsekvenser på pasientomsorgen. Gjeldende brukte protokollen er som følger: kliniske laboratorier benytte en rekke solide fase bekreftende tester for sykdomsassosierte ANAs og/eller en immunoadsorption-metode for DFS70/LEDGF når tett fine flekkete (AC-2) mønster er mistenkt (figur 1a)4,5.
Målet med denne protokollen er å demonstrere nytten av en roman konstruert HEp-2 IIF substrat (HEp-2 ELITE/DFS70 knockout (KO), vil bli referert til som HEp-2 ELITE) som beholder alle fordelene med konvensjonelle HEp-2 for screening ANAs samtidig skille DFS70 mønster med høy visshet i både monospecific og mixed ANA positive tilfeller (figur 1B, gul skyggelagt av algoritmen)5. HEp-2 ELITE substrat består av en omtrentlig blanding av uforandret konvensjonelle HEp-2 celler og utviklet celler uten LEDGF/p75/DFS70 antigen i 1:9 ratio5. IIF prosedyren for HEp-2 ELITE er identisk med metoden for konvensjonelle HEp-2. Den unike konfigurasjonen av HEp-2 ELITE underlaget ikke bare beholder alle fordelene med konvensjonelle HEp2, men kan skille homogen, flekkete og blandet reaksjonsmønstre fra DFS70 mønster på første screening eller testing av en prøve (figur 1B )5. Pasienten sera å være reagert på lysbilder med HEp-2 IIF underlaget må fortynnes 1:40 screening fortynning eller som enkelt laboratorium kriteriet. En spesifikk reaksjon på 1:40 eller høyere titer anses positiv.
I denne studien, positiv sera for homogen, flekkete, centromere, nucleolar, cytoplasmatiske reticular/AMA og DFS70 mønstre som produserte et middels positivt signal (i forhold til negative kontroll og positiv ANA kontroll av kit) på screening fortynning av 1:40 ble valgt for å simulere mono-spesifikke og blandet mønstrene på HEp-2 underlag (konvensjonell og HEp-2). 1:40 utvannet DFS70 positive sera ble blandet med 1:40 fortynninger av enkelte sykdomsassosierte ANA mønster kontroller (homogen, flekkete, centromere, nucleolar, eller cytoplasmatiske reticular-AMA) i forskjellige forhold (kontroll: DFS70 i 100:0, 80:20, 50/50, 20:80 og 0:100) og evalueres på konvensjonelle og HEp-2 ELITE underlag IIF-standardprosedyre som beskrevet nedenfor.
Autoantistoffer mot kjernefysiske og cytoplasmatiske antigener er svært utbredt i systemisk autoimmune sykdommer. Selv om ingen enkelt analysen gir best mulig sensitivitet og spesifisitet, er IIF av HEp-2 ansett som en svært følsom og kostnadseffektiv screening metode for systemisk autoimmune sykdommer2,3,4 . Til tross for utbredelsen av IIF protokoll for mer enn 50 år er nøyaktigheten av IIF analysen svært avhengig av dyktighet av teknikeren, forsiktig gjennomføring av de individuelle trinnene av protokollen, og nøyaktig tolkning av resultater bruker en godt vedlikeholdt fluorescens mikroskop. Diagnostisering av systemisk autoimmun sykdom bør ikke være basert på resultatene av en enkelt serologisk test som IIF av HEp-2.
Rekonstituering reagenser bruker høykvalitets vann (destillert/vaskebuffer), bruk av standardiserte kit komponenter (lysbilder med HEp-2 celle monolayers, prøve fortynningsmiddel, positive og negative kontroller, pre utvannet optimalisert FITC-konjugert og montering medium) ha en positiv innvirkning på resultatene. Hoppe tillegg kontroller eller eksempler på brønner kan oppfordre falske negative tolkninger. Tørking av lysbilder når som helst etter tillegg av prøve eller kontroll kan resultere i artifactual false positiv reaksjonene og upassende mønstre. For mye vaskebuffer igjen på lysbildet eller tørking av lysbildet før dispensasjon av montering medium kan føre gjenstander. Legge utilstrekkelig antall montering medium eller generere bobler på lysbildet overflaten før plassere en dekkglassvæske kan medføre reaksjoner som uklare og ute av fokus når observert under mikroskopet. Montert lysbilder må lagres på 2-8 ° C og analyseres i vinduet anbefalte tid å minimere falske negative eller artifactual resultater.
Bruke et velholdt epi-fluorescerende mikroskop som huser en passende LED/Hg/Xenon lyskilde og rent optisk komponenter inkludert eksitasjon og utslipp filtre som ikke er skadet er avgjørende for å oppnå nøyaktig IIF resultater. Opplæring for kresne positive/negative reaksjonen intensitet og tolkning av mønstre er avgjørende. HEp-2 IIF analyser er sårbare for mangelen på standardisering i prosedyrer, konfigurasjon av mikroskopet og sluttbrukeropplæring eller dyktighet. Konsensus nomenklatur og representant mønstrene og eksempler på bilder anskaffes ved hjelp av forskjellige produsenter er gjort tilgjengelig av ICAP () for pedagogiske formål4. En HEp-2 celle mønster klassifisering treet fra ICAP for ulike kjernefysiske cytoplasmatiske og mitotisk mønstre er en verdifull ressurs for å lære små forskjeller mellom ulike mønstre som kan ligne til utrente øyne4. En av de viktigste eksemplene på et utfordrende mønster er DFS70 som også mangler en distinkt forening med en autoimmun betingelse som beskrevet i forrige avsnitt dette mønsteret er svært utbredt i sunn bestander5.
Avhengig av studien, utbredelsen av anti-DFS70 autoantistoffer varierer mellom sunn kohorter, ANA screening bestander og ANA positive individer uten bevis systemisk autoimmun sykdom9,16,20 ,30,31. DFS70 autoantistoffer er rapportert oppstår isolert og med andre sykdomsassosierte ANA mønstre. Isolert eller monospecific DFS70 mønster er rapportert i 2-22% av sunn kontroller, men i mindre enn 1% av tilfellene med autoimmune revmatiske sykdommer32. Basert på disse trendene, ble DFS70 mono-positive mønsteret foreslått som et kriterium utelate i autoimmune revmatiske sykdommer av ICAP komiteen3,31,32. ICAP komiteen, etablert for å fremme harmonisering av autoantibody test nomenklatur og tolkning av HEp-2 IIF resultatene, anbefaler rapportering DFS70 positivitet ved rapportering av ANA screening resultater4.
Før utelukker en systemisk autoimmun sykdom basert på DFS70 mono-positivitet, er det viktig å undersøke tilstanden til gjeldende screening og bekreftelse metoder (spesielt de spesifikt for DFS70). Avtale mellom DFS70 positivitet HEp-2 IIF og solid fase bekreftende analyser nemlig ELISA, CLIA og linje immunanalyse/dot blot metoder) store variasjoner mellom ulike studier13,22,25,33 . IIF tolkning og bekreftende analysen parametere som bidrar til uenigheten har vært diskutert tidligere5,13,34. En nylig foreslåtte immunoadsorption tilnærming til anti-DFS70 antistoff bekreftelse løser noen av gjeldende solid fase analyser (for DFS70), men krever labs for å utføre et ekstra trinn i IIF fremgangsmåte mistenkt prøver, som øker tiden pris og behandlingstid for rapportering resultater13. Dette ekstra trinnet er ikke nødvendig når HEp-2 ELITE/DFS70 KO celler brukes for rutine ANA screening. Dette reduserer den totale kostnaden og videre er det ingen innvirkning på behandlingstid som DFS70 mønster er fanges i første screening trinn27. En ytterligere ulempe med å bruke konvensjonelle HEp-2 IIF-metoden er ikke skille DFS70 mønster co oppstår med andre ANA mønstre på screening scenen. Denne ulempen er imidlertid overvunnet ved bruk av HEp-2 ELITE/DFS70 KO celler27.
Sammenlignende evaluering av konvensjonelle HEp-2 og den nye utviklede HEp-2 (HEp-2 ELITE/DFS70 KO) med ANA positiv kontroller og kombinasjoner med en mono-positive DFS70 kontroll, viser verktøyet av nye underlagets samtidig skjerm for ANAs og Bekreft DFS70 mønster (figur 1). IIF protokollen for nye underlaget er identisk med det tradisjonelle HEp-2 IIF-metoden. Tolkning er for alle sykdomsassosierte ANA mønstre identiske unntatt DFS70 mønsteret (tabell 1). Tolkning av både mono-positive og blandet DFS70 mønstre var relativt enklere å bruke den nye metoden og det garanterer ikke ytterligere analyser (figur 1B). Gjennomføringen av denne ny metoden inne klinisk lab forenkler utfordringen knyttet til tolkning av DFS70 mønster og forbedrer generell nøyaktighet for ANA screening av ytterligere avslørende sykdomsassosierte ANA mønstre tidligere skjult av DFS70 (blandet mønstre).
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Andrew Zenger for utføre IIF eksperimenter og samle bilder.
HEp-2 ELITE / DFS70-KO 12 Well Slide sealed individually in pouch | Trinity Biotech | part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240 | |
ANA positive control | Trinity Biotech | part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240 | |
DFS70 antibody positive control | Trinity Biotech | part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240 | |
Negative control | Trinity Biotech | part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240 | |
Anti-human IgG FITC conjugate containing Evan's blue counterstain | Trinity Biotech | part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240 | |
Buffer diluent for serum | Trinity Biotech | part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Trinity Biotech | part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240 | |
Mounting medium | Trinity Biotech | part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240 | |
Coverslips | Trinity Biotech | part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240 | |
ImmuGlo ANA HEp-2 Cells 12 well slide sealed individually in pouch | Trinity Biotech | part of kit# 1103, 1103-240 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Materials used in the study but not provided by the kits | |||
Diagnostic fluorescent microscope | Nikon Eclipse 50i | Equipped with a spot dignostic camera, model 2.2.1 | |
Incubation chamber | Trinity Biotech | provided for customers (no catalog #) | |
Coplin jar | n/a | General labware | |
Paper towels | n/a | General lab supplies | |
distilled/deionized water | n/a | General lab supplies |